专利名称：玉米低温干旱诱导型启动子及活性分析的制作方法中国是一个人口众多的农业大国，粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。低温、 干旱等逆境是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子。近年来，由于全球气候变化导致干旱、洪涝、冰冻、热浪等极端气候事件频繁发生，给我国的农业生产造成了不利的影响。如去年冬季至今年早春的这段时间，我国北方大部分地区持续干旱，长期无雨和少雨形成的土壤干旱使作物根系不能从土壤中吸收足够的水分以补偿蒸腾的消耗而受害，导致植物出现生理性生长不良，抑制了植物的正常生长发育，进而导致其抗病能力下降，严重影响产量；2008年初发生在我国南方大部分地区的雨雪冰冻及低温冷冻灾害造成的直接经济损失达11亿多元。目前，干旱、低温等气象逆境对农业生产造成的损失人们还没有太好的办法进行防御。对于干旱，人们只能选择种植一些相对耐旱的作物或者是采用滴灌等先进的灌溉技术，然而目前先进的灌溉技术成本高，很难大范围的应用，而耐旱作物虽然耐旱，但不一定适合当地的其它气候条件及当地的种植习惯；对于低温，人们只能利用温室栽培或者推迟种植的方式来抵御，但温室建设增加了成本且不利于小麦等需要大面积种植的粮食作物的使用，而推迟种植时间也很难避开突发性的低温天气，更有可能错过作物的种植时间。这些都导致了人们对于干旱和低温等气象逆境的无奈。因此，科学研究者只能转而培育抗低温的品种。自转基因技术成熟以来，科学家们已经得到了很多转基因品种。然而，由于转入的基因大多数是由组成型启动子驱动表达的，组成型启动子具有高效表达、且在植物整个生长期都表达的特点，这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点，不利于植物的正常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，能够快速有效地诱导基因的转录，来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特定的组织器官、环境下诱导基因转录，解决组成型启动子面对的问题。迄今为止，从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。目前，分离和鉴定的低温、干旱诱导型启动子并不多，同时抗低温和干旱的启动子更少，一般为转录因子类蛋白基因的启动子，如DREB类、WRKY类、bZIP等。Shinozaki等 (1994)从拟南芥干旱和低温诱导表达的rd29A基因上游分离到该基因的启动子，该启动子能够被干旱、低温和高盐等非生物胁迫因素诱导驱动下游基因的表达，命名为rd29A启动子，同时识别出对启动子活性起关键作用的DRE元件TACCGACAT。rd29A启动子是目前抗逆植物基因工程中应用最广泛的诱导型启动子，被连接到许多转录因子基因的上游并转化入植物中，用以研究这些基因逆境胁迫诱导表达的方式。利用低温、干旱诱导型启动子驱动抗低温、干旱基因的高效表达，从而改良作物的耐低温、干旱性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗低温、干旱相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点ο
本发明的一个目的是提供一种低温、干旱诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米锌指蛋白基因ZmZFP。本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的低温、干旱诱导型启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因ZmZFP的低温、干旱诱导型启动子序列和5’非翻译区。本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚。该转基因玉米胚能反映启动子诱导活性的高低。为实现上述目的，本发明克隆了玉米锌指蛋白基因ZmZFP的低温、干旱诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmZFP基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达，并观察到该启动子与低温、干旱诱导相关的高水平活性。本发明提供一种获得的玉米低温干旱诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的-Ibp至-1645bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，低温、干旱可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。获得的玉米低温干旱诱导型启动子序列源自玉米锌指蛋白基因ZmZFP。一种克隆得到的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的5，非翻译区包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的+Ibp至+230bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的5’非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的低温、干旱诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米低温、干旱诱导型启动子序列和玉米锌指蛋白基因 ZmZFP的5，非翻译区。上述用于玉米转化的低温、干旱诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB (右边界序列) 和LB (左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens) Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如PCAMBIA1301载体、 PBI121 载体。一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚，包含玉米低温干旱诱导型启动子序列和玉米锌指蛋白基因ZmZFP的5’非翻译区。本发明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(PCAMBIA1301)，所述的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的PCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。本发明提供一种应用低温、干旱诱导型瞬时表达的玉米成熟胚。植物能通过使用根癌农杆菌(An，G. 1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法 (Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)将上述植物低温、干旱诱导型启动子二元载体进行转化。本发明提供来自玉米锌指蛋白基因ZmZFP的低温、干旱诱导型启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行低温、干旱诱导表达。本发明的有益效果在于可用于启动抗低温、干旱基因的高效表达，应用于不耐低温、干旱的植物中使植株获得抗低温、干旱的性状，对于解决低温、干旱地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。图1为玉米(B73)基因组电泳 2 为 ZmZFP-pro PCR 电泳3为ZmZFP-pro连T载酶切鉴定电泳 4 为 ZmZFP-pro 连 pCAMBIA-1301 PCR 鉴定电泳5为ZmZFP-pro连pCAMBIA-1301酶切鉴定电泳6为pCAMBIA 1301 ZmZFP-Pro转农杆菌PCR鉴定电泳7为植物表达载体构建示意8为ZmZFP启动子的⑶S检测(背面)照片图9为ZmZFP启动子的⑶S检测(正面)照片 图10为ZmZFP启动子的⑶S检测(背面)照片图11为ZmZFP启动子的⑶S检测(正面)照片图 8 和 9 中ZmZFP(a) :4°C处理；ZmZFP (b)未处理；35S图10和11中=ZmZFP(a) 20% PEG处理；ZmZFP(b)未处理；35S 应用最广泛的组成型启动子

来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。实施例1 玉米锌指蛋白基因ZmZFP的低温干旱诱导型启动子的克隆玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID N0:1的转录起始位点的-Ibp至-1645bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米ZmZFP基因的5，区序列中得到鉴定。玉米锌指蛋白基因ZmZFP登录在NCBI GenBank (登录号EU963900. 1)，序列表显示本发明上述基因的植物低温、干旱诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在本文件的
5启动子序列表中，转录起始位点的碱基G用+1示出，ATG用红色下划线标注。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站http://bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/0以玉米基因组DNA (图1)为模板，扩增得到目的片段，经1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 扩增出长度为1875bp的条带(图2)，并进行回收。回收片段与PMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T: ZmZFPftO，提取质粒并进行酶切验证(图3)，并测序。更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子和230bp的 5’非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，反应程序 950C 3min ；95°C 30S，58. 5°C 30S，72°C 2min，32 个循环；72°C IOmin ；表1:引物


玉米低温干旱诱导型启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供了一种获得的玉米低温干旱诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO1的转录起始位点的-1bp至-1645bp区的DNA核苷酸序列；同时提供用于玉米转化的低温干旱诱导型的植物表达载体，包含玉米低温干旱诱导型启动子序列和玉米锌指蛋白基因ZmZFP基因的5′非翻译区；用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚；SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的PCR引物适于扩增包含SEQ IDNO1的序列DNA片段；本发明可用于启动抗低温、干旱基因的高效表达，应用于不耐低温、干旱的转基因植物中使植株获得抗低温、干旱的性状，对于解决低温、干旱地区粮食危机问题有积极意义。