一种新生重组启动子及其应用的制作方法[0002]重组DNA技术自上世纪七十年代创立以来发展非常快速，不仅产生了分子生物学这ー新生学科，也拓展了各类生命学科及其相关学科的前沿基础研究，并且建立了动物、植物、微生物等的细胞、组织、器官、个体等转基因系统，这些研究成果的广泛成功获得各种大量的转基因产物，特别是建立了在临床医学中对与疾病治疗和应用相关的基因工程与基因治疗等体系。这些发展既具有商业性、经济性等方面巨大的建设与价值，也产生理论性、社会性等深远的影响与意义。[0003]利用重组DNA技术建立的各种转基因系统，包括利用重组载体(Vector)或重组质粒(Plasmid)或其它特异重组DNA等,将人工分离或修饰的基因导入到生命体细胞内或进入基因组中，导入基因的表达可以引起宿主生命体性状的可遗传的修饰,建立的这一重组DNA技术系统称之为转基因系统。[0004]在转基因过程中，体外构建重组载体或重组质粒或其它特异重组DNA等必不可少，通常其含有复制起点、启动子、标记基因、翻译控制元件、转录终止子等各种元件、或其组合元件，使可携帯经过人工改造的目的基因或DNA片段进入宿主细胞内或进入基因组内。[0005]随着重组DNA技术的广泛应用，除转基因系统体外构建的重组载体或重组质粒或其它特异重组DNA等外，还包括大量构建的不同容量的重组DNA库、突变DNA库及其筛选系统等。这些重组DNA技术的产物也已在自然环境中分布，许多已知的这类基因存在于转座子、整合子或质粒中，能够通过接合(conjunction)或水平基因转移(horizontal genetransfer, HGT)等方式进入到同种甚至不同种的其它细菌等生命体,如在人类的ー些病原生物和共生细菌(肠道微生物群)中都有抗性基因转移的证据等，但是否已进入人体内细胞或基因组、是否进入人体内细胞或基因组表达并引起作用，国际社会在非常密切关注中。[0006]启动子是基因表达调控的重要元件，是指基因中一段具有准确有效起始基因转录功能的DNA序列，通常位于基因上游。启动子通过与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用，来调控基因转录的水平及其时空表达的特异性。[0007]目前本领域对于重组DNA技术中进入人体或非人哺乳动物中的作用机制尚不明确，因此对于是否进入人体内细胞或基因组表达并引起作用、是否由新生重组启动子或新连接的启动子转录表达，包括人体内外源重组DNA的转录本或翻译产物或DNA片段及其对人体内源基因组DNA或其来源的转录本与翻译产物的影响等，因此迫切需要进行此方面的研究与应用。

[0008]本发明的目的就 是提供ー种新生重组启动子及其应用。[0009]在本发明的第一方面，提供了一种分离的启动子，所述的启动子为任选自下组的多核苷酸:
[0010](a)核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸；
[0011](b)核苷酸序列与SEQ ID N0.:1所示序列的同源性≥95% (较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸；
[0012](c)如SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端增加和/或减少1-50个(较佳地1-10，更佳地1-50个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸；
[0013](d)具有转录上/下游DNA片段活性的任选自(a)的连续的多核苷酸片段；或其衍生物。
[0014]在另ー优选例中，(d)中所述的启动子为任选自下组的多核苷酸:
[0015](a)核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所不的多核苷酸；
[0016](b)核苷酸序列与SEQ ID N0.: 2所示序列的同源性≥95% (较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸；
[0017](c)如SEQ ID N0.: 2所示多核苷酸的5’端和/或3’端增加和/或减少1-50个(较佳地1-10，更佳地1-50个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸。
[0018]在另ー优选例中，(d)中所述的启动子为任选自下组的多核苷酸:
[0019](a)核苷酸序列如SEQ ID N0.:3所不的多核苷酸；
[0020](b)核苷酸序列与SEQ ID N0.: 3所示序列的同源性≥95% (较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸；
[0021](c)如SEQ ID N0.: 3所示多核苷酸的5’端和/或3’端增加和/或减少1-50个(较佳地1-10，更佳地1-50个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸。
[0022]在另ー优选例中，所述的启动子是新生重组启动子。
[0023]在另ー优选例中，所述的启动子分离自人或非人哺乳动物。
[0024]在另ー优选例中，所述的启动子来源于外源重组DNA。
[0025]在另ー优选例中，所述的外源重组DNA选自下组:表达载体或其片段、表达质粒或其片段、穿梭载体或其片段、穿梭质粒或其片段、重组载体或其片段、重组质粒或其片段、或其它特异重组DNA或其片段。
[0026]在另ー优选例中，所述重组载体为pBR322、pUC18/19、pFLAG、pGL、pGEM_T、pCMV、pBluescript、pcDNA系列，或上述载体的片段。
[0027]在另ー优选例中，所述的重组载体为pBR322。
[0028]在本方面的第二方面，提供了ー种构建物，所述的构建物含有外源基因或外源DNA片段，以及与所述的外源基因或DNA片段可操作连接的第一方面所述的启动子。
[0029]在另ー优选例中，所述的构建物分离自人或非人哺乳动物。
[0030]在另ー优选例中，所述外源基因选自下组:筛选标记基因、抗性基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制剂基因、或其组合。
[0031]在另ー优选例中，所述的筛选标记基因为荧光素酶编码基因。[0032] 在另ー优选例中，所述的抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。
[0033]在本发明的第三方面，提供了ー种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次为:第一方面所述的启动子、外源基因编码序列、和終止子。
[0034]在另ー优选例中，所述的表达盒分离自人或非人哺乳动物。
[0035]在本发明的第四方面，提供了ー种载体，所述载体含有第三方面所述的表达盒。
[0036]在本发明的第五方面，提供了ー种宿主细胞，所述宿主细胞含有第四方面所述的载体、或其染色体整合有外源的第一方面所述的启动子、或其染色体整合有第三方面所述的表达盒。
[0037]在另ー优选例中，所述的宿主细胞来源于人或非人哺乳动物；较佳地来源于人。
[0038]在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为牛、羊、兔、鼠、猪。
[0039]在本发明的第六方面，提供了第一方面所述启动子、第二方面所述构建物、或第三方面所述表达盒的用途，它被用于调控外源基因或外源DNA片段的特异性表达。
[0040]在本发明的第七方面，提供了一种检测方法，包括步骤:
[0041](a)获得待检测样本的DNA，检测所述DNA中是否含有第一方面任一所述的启动子;
[0042](b)对于含有所述启动子的样本，检测所述的启动子上/下游是否具有所述启动子能够转录的基因或DNA片段；
[0043](c)对于具有所述启动子能够转录的基因或DNA片段的样本，检测所述被转录的基因或DNA片段是否为来自于外源的基因或DNA片段。
[0044]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。



[0045]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0046]图1显示了新生重组启动子区及其相关构成；图1A显示了新生重组启动子区的相关ColEl元件、rAmp ORF元件和Ampr ORF元件及其位置与方向；图1B显示新生重组启动子区的序列，下划线部分为rAmp 0RF(1~267)序列。
[0047]图2显示新生重组启动子的活性与序列；图2A显示新生重组启动子的活性结果；图2B显示新生重组启动子的序列。
[0048]图3显示包含新生重组启动子的重组质粒转染HEK293细胞时有rAmp RNA表达。
[0049]图4显示人体内血液白细胞的基因组DNA中存在来自于外源重组质粒的新生重组启动子与rAmp DNA连接区段及其序列；图4A显示人血液白细胞的基因组DNA中存在来自于外源重组质粒的新生重组启动子与rAmp DNA连接区段(M:混合白细胞；A:贴壁白细胞；U:非贴壁白细胞)；图4B显示上述PCR扩增的该连接区段经DNA测序确定；图4B显示人体内血液白细胞中有rAmpRNA表达CM:混合白细胞；A:贴壁白细胞；U:非贴壁白细胞)；图4C显示:泳道1-3分别对应总细胞M组、贴壁细胞A组和非贴壁细胞U组，泳道4为PCR阴性对照，泳道5为PCR阳性对照，新生重组启动子转录表达了 rAmp RNA。
[0050]本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，人体内天然酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶I(ACATl)基因的转录本能够与来自于外源重组载体的氨苄青霉素抗性基因的转录本(rAmp)发生反式剪接,从而形成一种新转录本及其翻译产物,这种rAmp的转录表达是由ー种新生重组启动子启动的。具体地，本发明提供了ー种新生重组启动子，所述启动子为如SEQ ID N0.:1所示的核苷酸序列，或者选自该序列的连续的活性片段。该启动子与外源基因连接，具有与高活性SV40启动子相近的启动活性。
[0051]术语
[0052]如本文所用，术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为RNAs，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5，端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
[0053]如本文所用，术语“本发明的启动子”、“本发明的新生重组启动子”、“新生重组启动子”可以互换使用。本发明的所述的启动子具有选自下组的多核苷酸:核苷酸序列如SEQID N0.:1所示的多核苷酸；核苷酸序列与SEQ ID N0.:1所示序列的同源性<=95% (较佳地<=98%，更佳地<=99%)，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸；如SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端增加和/或减少1-50个(较佳地1-10，更佳地1-50个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸；具有转录上/下游DNA片段活性的任选自(a)的连续的多核苷酸片段；或其衍生物。
[0054]优选地，所述的启动子为任选自下组的多核苷酸:核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所示的多核苷酸；核苷酸序列与SEQ ID N0.: 2所示序列的同源性<=95%(较佳地<=98%，更佳地<=99%)，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸；如SEQ ID N0.: 2所示多核苷酸的5’端和/或3’端增加和/或减少1-50个(较佳地1-10，更佳地1-50个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸。
[0055]或优选地，所述的启动子为任选自下组的多核苷酸:核苷酸序列如SEQ ID N0.:3所示的多核苷酸；核苷酸序列与SEQ ID N0.:3所示序列的同源性<=95%(较佳地<=98%，更佳地<=99%)，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸；如SEQ ID N0.: 3所示多核苷酸的5’端和/或3’端增加和/或减少1-50个(较佳地1-10，更佳地1-50个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有转录上/下游DNA片段活性的多核苷酸。
[0056]本发明所述的启动子优选为重组新生启动子；优选分离自人或非人哺乳动物；或来源于外源重组DNA。所述的外源重组DNA选自下组:表达载体或其片段、表达质粒或其片段、穿梭载体或其片段、穿梭质粒或其片段、重组载体或其片段、重组质粒或其片段、或其它特异重组DNA或其片段。所述重组载体为pBR322、pUC18/19、pFLAG、pGL、pGEM_T、pCMV、pBluescript、pcDNA系列，或上述载体的片段。在另ー优选例中，所述的重组载体为PBR322。
[0057]在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体,启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
[0058]本发明还包括与本发明的启动子序列具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也具有特异性调控启动植物地上组织表达的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。
[0059]如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织的表达。
[0060]如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
[0061 ] 如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。
[0062]本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。本发明所述的外源基因(也称为目的基因)没有特别的限制，代表性例子包括(但不限干):筛选标记基因、抗性基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因等。
[0063]所述的筛选标记基因选自下组:荧光素酶基因、gus(P-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(緑色荧光蛋白)基因。
[0064]所述的抗原蛋白基因及生物制剂基因选自下组:细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB - pins)、或生物制剂(如a 2b干扰素,胰岛素样生长因子等)。
[0065]所述的抗性基因选 自下组:新霉素抗性基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。
[0066]本发明还提供了ー种基因表达盒，所述表达盒从5’-3’依次为:启动子、基因ORF序列、和终止子。优选地，所述启动子序列如SEQ ID N0.:1所示或与SEQ ID N0.:1所示序列的同源性> 80%，较佳地> 90%，较佳地> 95%，较佳地> 98%，更佳地> 99%。
[0067]本发明还提供了ー种包括本发明的启动子和/或基因表达盒的重组载体。作为ー种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少ー个酶切位点。当需要表达目的基因吋，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另ー种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向):启动子，目的基因，和終止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件:3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
[0068]用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被米用的。
[0069]本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术
坐寸o
[0070]本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌:或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
[0071]应用
[0072]本发明启动子、构建物、或表达盒等可用于调控外源基因的特异性表达，所述启动子启动活性很高，启动活性与高活性的SV40启动子相近。
[0073]本发明还提供一种检测方法，包括步骤:获得待检测样本的DNA，检测DNA中是否含有权利要求1任一所述的启动子；对于含有所述启动子的样本，检测所述的启动子上/下游是否具有所述启动子能够转录的基因或DNA片段；对于具有所述启动子能够转录的基因或DNA片段的样本，检测所述被转录的基因或DNA片段是否是来自于外源的基因或DNA片段。
[0074]本发明的主要优点:
[0075](1)人体内天然酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶I(ACATl)基因的转录本能够与来自于外源重组载体的氨苄青霉素抗性基因的转录本(rAmp)发生反式剪接，从而形成ー种新转录本，这种rAmp转录表达是由ー种新生的重组启动子启动的。
[0076](2)本发明的启动子转录效率很高，具有与高活性的SV40启动子相近的活性。
[0077]下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0078]材料和方法
[0079]试剂
[0080]细胞培养基DMEM购自Gibco公司[0081 ] 胎牛血清购自PAA公司
[0082]MMLV-逆转录酶、DNase和Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统购自Promega 公 ロJ
[0083]Taq DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司
[0084]TRIzol Reagent 购自 Sigma 公司
[0085]转染试剂FuGENE 6购自Roche公司
[0086]引物寡聚核苷酸由上海生エ生物技术有限公司合成。
[0087]表达质粒的构建
[0088]利用引物对ulOOOF/uR、引物对u850F/uR和引物对ul000F/u851R (表1)从表达质粒pcDNA3 (购自Invitrogen公司)中经PCR扩增得到目标片段，将上述片段经Xho I和Hind III双酶切后，分别克隆进表达质粒PGL3-B质粒(购自Promega公司)的相应酶切位点，得到表达质粒 prAmp-ulOOO、prAmp-u850 和 prAmp_ucl50。[0089]表1
[0090]

申请人:中国科学院上海生命科学研究院