一种纤维伸长期优势表达的启动子及制备方法和应用的制作方法【技术领域】。更具体涉及一种棉花纤维发育时期特异启动子，及一种纤维伸长期优势表达的启动子的用途。通过克隆、鉴定两个棉花纤维伸长期特异性启动子，将其应用于棉花纤维品质改良的遗传转化。[0002]棉花纤维是一种重要的纺织业原料，对棉花纤维的遗传改良有利于棉纺工业的发展，棉花纤维细胞从开花当天开始，经历起始，延长，次生壁沉积及成熟四个阶段，最后发育成一个长达3厘米左右、次生壁中纤维素含量达百分之九十多的纤维细胞。为此，对棉花纤维细胞的研究是改良纤维品质的重要手段。[0003]真核生物基因的表达受到转录前、转录水平、转录后加工、转运、翻译水平以及蛋白活性的调控，其中转录水平的调控是基因表达中最基本的环节，启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达的空间、时间和表达的强度，是人们利用基因工程和转基因技术定向植物的重要限制因素。[0004]目前一批棉花组织特异启动子已经得到表达特性分析(John和Crow, Geneexpression in cotton(Gossypium hirsutum L.)fiber:Cloning of the mRNAs, ProcNatl Acad Sci U S A, 89:5769-73 1992 ；Rinehart 等，Control of plant trichomedevelopment by a cotton f iber Myb gene, Plant Cell,16:2323-2334，2004 ;Zhang等，Members of a new group of chitinase—like genes are expressed preferentiallyin cotton cells with secondary walls, Plant Mol Biol,54:353-72, 2004 ；Li 等，The cotton actinl gene is functionally expressed in f ibers and participatesin fiber elongation,Plant Cell, 17:859-875, 2005 ；ffu 等，Isolation of a cottonreversibly glycosylated polypeptide (Ghrgpl) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, J Plant Physiol, 163:426-35，2006)。这些启动子中 E6 表达高峰在纤维发育10天左右，FbL2A启动子在开花后20天纤维中特异表达，表达高峰在纤维发育的第35DPA。由于棉花纤维特异启动子在棉花基因工程改良中的潜在应用价值，使几乎所有的棉花纤维特异启动子都申请了专利。目前利用已有纤维特异启动子对棉花纤维发育相关基因进行功能验证的相关研究还比较少。[0005]传统的育种方法对棉花产量潜力的挖掘和纤维品质的提高在近年来进展不大，现有的棉花种质资源已使棉花的产量和品质达到某种平台。生物技术的快速发展及其在农业上的应用为作物育种和生产提供了新途径，形成农业发展的第二次绿色革命。转基因育种及基因功能验证除了对目标基因有要求，启动子也是一个不可忽视的方面。目前，棉花的基因工程中普遍使用是组成型CaMV35s启动子。在棉花的抗虫基因工程中逐渐暴露了组成型启动子的诸多缺点。因此分离鉴定棉花纤维特异高效表达启动子无论在棉花基础研究还是在分子育种研究中都有重要的应用价值。
[0006]本发明的目的是在于提供了一种棉花纤维伸长期优势表达启动子，该启动子主要在伸长期优势表达，伸长期对于棉花纤维来说是一个非常关键的时期，在遗传改良中运用该启动子特异的表达某些对纤维高品质的形成非常关键的基因将会增加棉花的产量而不影响其他组织器官的生长。[0007]本发明的再一个目的是在于提供了一种棉花纤维伸长期优势表达启动子在棉花纤维品质改良的遗传转化中的应用，利用该启动子转化棉花。现有的常用于转基因的是组成型CaMV35s启动子，它能够驱动基因在整个生育期及各个组织表达，在棉花的抗虫基因工程中逐渐暴露了组成型启动子的诸多缺点。该启动子在纤维中高效优势表达，因此棉花纤维特异高效表达启动子无论在棉花基础研究还是在分子育种研究中都有重要的应用价值。
[0008]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:
[0009]一种棉花纤维伸长期优势表达启动子的制备方法，其步骤是:
[0010]A、本研究是在研究海岛棉纤维发育相关基因表达谱的基础上发掘的一个在陆地棉纤维伸长期高丰度表达的基因GhGLP2及在海岛棉(请见填写遗传资源表)伸长期高丰度表达的基因GbGLP3。
[0011]B、进而进行该基因伸长期优势表达的验证(图2)，图2A为一种GhGLP2的RT-PCR的结果示意图。以看出在纤维的不同发育时期都有表达，表达的高峰时在5-15DPA。但在根和叶中是没有的表达的。图2B是GbGLP3的RT-PCR的结果，在0-20DPA的纤维中不同发育时期的表达高峰时在10DPA和1OTPA。
[0012]C、用Genomewalking克隆基因的启动子序列(图1)。根据试剂盒对PCR引物的要求设计基因特异引物。扩增基因GhGLP2和GbGLP3的启动子。在凝胶电泳后用凝胶回收试剂盒回收目的片段(Qiagene, Germany Cat.N0.28704)后进行TA克隆,测序。一种分离的启动子，PGhGLP2启动子长度为1332bp，其序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。一种分离的启动子，PGbGLP3启动子长度为641bp其序列为SEQ ID NO:2所示的核甘酸序列。
[0013]本发明提供的棉花纤维伸长期优势表达的两个启动子名称分别命名为PGhGLP2和PGbGLP3，其序列为SEQ ID NO:1所示的核甘酸序列和序列为SEQ ID NO:2所示的核甘酸序列。
[0014]本发明制备的启动子PGhGLP2和PGbGLP3，扩增所述PGhGLP2和PGbGLP3全长及其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0015]所述重组表达载体具体可为如图4所示的表达载体或将其他元件替换但包含PGhGLP2和PGbGLP3启动子的表达载体。
[0016]一种棉花纤维伸长期优势表达启动子在棉花纤维品质改良的遗传转化中的应用，其步骤是:
[0017]1、无菌苗的培养
[0018]将棉籽壳(品种名称)去掉，用0.1/100的升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基上(配方如下:2/lMS大量元素+葡萄糖15g.L-1+植物胶phytagel 2.5g.171)，在28°C，暗培养3-6天。
[0019]2.农杆菌的活化和保存[0020]2.1 准备:
[0021]农杆菌LBA4404 (请见填写遗传资源表)，制备含卡那霉素50mg.L—1的MGL液体培养基(配方:胰化蛋白胨 5g/L，氯化钠 5g.1AMgSO4.7H20 0.lg.L-1，KH2PO40.25g.L-1，甘露醇5g.L—1，甘氨酸1.0g.L—1，调pH至7.0)，无菌三角瓶，LB (固、液)培养基(含卡那霉素50mg.L—1),灭菌甘油,无菌枪头,无菌1.5mL离心管。
[0022]2.2 操作:
[0023]2.2.1 活化，悬浮:
[0024]从超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5°C暗培养36-48hr，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5 °C暗培养36-48hr，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，28°C、200rpm摇2hr，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。
[0025]2.2.2菌株(EHA4404 (请见填写遗传资源表))的保存:
[0026]从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpm，26°C摇48hr，按菌液和甘油体积比为1:1加入1.5mL离心管混匀，-70°C保存。
[0027]3.浸染，共培养:
[0028]3.1 准备:
[0029]暗培养5天左右幼嫩健壮的YZ-1幼苗，经活化的农杆菌(EHA4404 (请见填写遗传资源表))，无菌培养皿和无菌滤纸等。
[0030]3.2 操作:
[0031]无菌条件下将YZ-1幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-lcm长的切段，转入到经活化的农杆菌菌液中，搅匀，静置5-10分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，薄层分散布于垫有滤纸的共培养培养基中(配方:调pH至7.0)，于19-21°C暗培养38-42小时。
[0032]4.愈伤组织的诱导
[0033]将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上(配方如下:MS无机盐+B5有机物 +2, 4-D 0.lmg.L ^KT0.lmg.L 1 葡萄糖 30g.L 1+phytagel 2.5g.L 调 pH 至 7.0,调 pH至 7.0)。
[0034]5、非胚性愈伤组织的增殖
[0035]非胚性愈伤组织的增殖培养基如下所示:MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5 有机物 +2, 4-D 0.05mg.L ^KT0.lmg.L 丨+葡萄糖 30g.L 1+phytagel 2.5g.L S 调 pH至 7.0。
[0036]6、愈伤组织的分化
[0037]愈伤组织经继代(一个月继代一次)几次后，有的愈伤组织转化成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上(配方=MS基本培养基+B5有机物+激动素(KT)0.15mg.L—1+吲哚丁酸(IBA)0.5mg.171+ 葡萄糖 30g.171+phytagel 2.5g.L-1,调 pH 至 7.0),进一步分化成胚状体。
[0038]7、胚性愈伤组织的继代
[0039]胚性愈伤组织的继代培养基如下所示:
[0040]MS无机盐(其中硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+KT 0.15mg.1^+IBA0.5mg.L-1+Gln (谷胺酰胺)1.0mg.171+ 天冬酰胺(As n) 0.5mg.171+ 葡萄糖 30g.L_1+phytagel 2.5g.L-1调 pH 至 7.0。
[0041]8、成苗生根培养
[0042]将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上(配方:1/2MS无机盐+B5 有机物 + 葡萄糖 15g.L—1+phytagel 2.5g.L_S 调 pH 至 7.0)。
[0043]9、炼苗移栽
[0044]将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田。
[0045]附:MS培养基母液配制:
[0046]1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解，逐一加到容量瓶中，一定要最后加入CaC12否则容易产生沉淀，定容到一升。
[0047]2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下10小时以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。
[0048]3.配制铁盐时，两种盐用热水分别溶解，然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。
[0049]4.各种生长激素一般可以用I摩尔/升的NaOH或HCl溶解后，再定容。
[0050]5.配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染
[0051]6.各种母液配制好后应存放在4°C冰箱中，发现有沉淀后，不得使用。
[0052]大量元素(20倍)母液(g/L)