一种高活性生物衍生材料及其制备方法与应用的制作方法【技术领域】，具体涉及一种高生物活性生物衍生材料及其制备方法。[0002]生物衍生材料具有与细胞外基质相似的结构和良好的生物相容性，是一种非常有优势的组织工程支架材料。在众多的生物衍生材料中，小肠粘膜下层(SIS)具有低免疫原性，抗菌性和促进组织生长等优势，所以被认为是一种非常理想的组织工程支架材料。[0003]SIS中含有丰富的蛋白多糖、胶原蛋白和纤维粘连蛋白，能促进细胞与组织间的黏附、增殖和分化。蛋白多糖常在细胞黏附的早期阶段，如细胞的附着和伸展阶段起作用；胶原蛋白通过I型胶原的α I链，纤维粘连蛋白通过RGD序列与细胞膜受体特异结合，激活信号传导通路促进细胞黏附。[0004]SIS包含的多种生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、喊性成纤维细胞生长因子(b-FGF)等在组织的修复和重构中有着重要的促进作用。SIS具有独特的解剖结构:胶原纤维间的类肝素硫酸蛋白聚糖主要集中在血管；呈弥散分布；VEGF则主要分布在血管周围。这种结构在组织再生中发挥重要作用。[0005]目前处理SIS的方法主要有物理处理法和化学处理法。物理处理法多为简单的机械刮除法，即用机械或手工的方式刮除除小肠粘膜下层以外的小肠肌层、浆膜层和小肠粘膜层三层结构，并用纯化水或生理盐水冲洗干净。这种方法由于只有简单的物理处理方法，所以这种处理方法对于SIS中原有含有的生物活性成分，尤其是生长因子的保留具有很好的效果，但是这种方法并没有进一步去除SIS中剩余的细胞成分，而细胞成分是生物衍生材料的主要抗原形成，所以在植入体内时会有一定的免疫风险存在。而化学处理方法多为单纯的脱细胞过程和去垢过程，其中一些处理过程对于生物衍生材料中所含有的生物活性物质影响较大。如中国专利CN101433735A公开的一种SIS组织修复材料的制备方法，具体公开了将小肠粘膜下层以任意顺序进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、去垢处理，最后经冷冻干燥而成，进而制成用于皮肤缺损、泌尿系统缺损、粘膜缺损以及其他体表体内软组织损伤的组织修复材料，通过多步法实现了对原有材料免疫原性的处理。然而该方法中为了实现去除抗原免疫性，在脱脂处理中采用了大量的有机溶剂，并且采用了大量的表面活性剂和酶对处理后的生物衍生材料进行除垢处理。但是所用的表面活性剂、有机溶剂或酶可能会导致生物衍生材料中的活性成分变性或降解，使得生物衍生材料降低甚至丧失生物活性，不利于生物衍生材料对皮肤或组织缺损的修复；其次，由于有机溶剂和表面活性剂具有一定的毒性，因此为了避免生物材料活性中毒，需要清洗所使用的残留有机溶剂，要求频繁的换液处理，导致处 理时间较长，处理时间最短为2天，整体的工艺成本增加；更重要的是会使得处理后的衍生材料的生物活性受到较大的影响。
[0007]本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种高活性的生物衍生材料。
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备高活性生物衍生材料的方法，包括如下步骤:
[0009](I)取动物的粘膜下层为原料，进行清洗并消毒，备用；
[0010](2)取上述消毒处理后的材料投入高渗透压盐溶液中，在超声条件下进行振荡浸泡l_20min，取出所述处理后的材料并加纯化水浸泡，在超声条件下进行振荡浸泡
1-20min,随后排出加入的溶液，随后在超声条件下，以所述高渗透压盐溶液和水对所述材料进行交替振荡浸泡处理，各重复循环操作4-6次；
[0011 ] (3)将上述步骤(2)中浸泡处理后的材料进行去垢及清洗处理，并将处理后的材料冻干，即得所述高活性生物衍生材料。
[0012]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述步骤(2)中，各次所述超声振荡浸泡步骤的超声波频率彼此独立的为10-30kHz。
[0013]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述步骤(2)中，各次所述超声振荡浸泡步骤的超声波频率为25kHz。
[0014]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述步骤(2)中，所述高渗透压盐溶液的质量浓度为5-30%。
[0015]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述高渗透压盐溶液的质量浓度为20%。
[0016]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述步骤(2)中，所述高渗透压盐溶液的体积用量为所述原料材料重量的2-5倍；所述纯化水的体积用量为所述原料材料重量的
2-5倍。所述体积用量与所述重量为kg/L的关系。
[0017]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述步骤(2)中，所述高渗透压盐溶液超声浸泡的时间为5min ;所述纯化水超声浸泡的时间为5min。 [0018]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述步骤(1)中，所述消毒步骤所采用的消毒液为质量浓度为0.1-3%的过氧化氢、0.1-3%过氧乙酸或0.1-3%过氧丙酸溶液之一与质量浓度为0.1%-15%的乙醇或0.1%-15%异丙醇之一的混合水溶液。
[0019]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述消毒液为质量浓度为0.5%的过氧乙酸溶液与5%的乙醇溶液的混合水溶液。
[0020]所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述步骤(3)中，所述去垢步骤是采用质量浓度为0.5%-3%的Triton X100,Triton Χ114、0.1%-0.5%的十二烷基硫酸钠溶液为去垢剂，进行浸泡去垢1-5次，每次去垢处理时间为10min-20min ;所述清洗步骤采用生理盐水进行处理。
[0021]优选的，所述的制备高活性生物衍生材料的方法，所述步骤(3)中，所述动物的粘膜下层为小肠粘膜下层。
[0022]本发明提供了一种由上述的方法制备得到的高活性生物衍生材料。
[0023]本发明还提供了一种高活性生物衍生材料在用于体表损伤修复材料的应用。
[0024]本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点:[0025](1)本发明所述的制备高活性生物衍生材料的方法，在超声条件下采用高渗透压盐溶液-纯化水间歇联合使用的方式，去除生物衍生材料中含有的细胞，降低其抗原性，实验证明，仅仅采用高渗透压-纯化水与超声处理的方式即可有效去除材料含有的细胞，避免了现有技术中需要使用有机溶剂和蛋白酶、核酸酶等去除抗原造成的诸多不足，使得本发明制备的生物衍生材料不仅抗原性低，组织学检测无细胞残留，DNA含量显著低于单纯机械法制备的生物衍生材料，且植入体内后无严重炎性反应，克服了有机溶剂和表面活性剂长时间处理而残留过量致使生物衍生材料具有毒性的问题，具有高度的安全性和有效性，同时最大程度保留了生物衍生材料中的活性物质，使得生物衍生材料中的生物活性物质含量高，进而有助于其对创面或组织的修复；
[0026](2)本发明所述方法省略了现有技术中以有机溶剂进行脱脂处理去抗原的步骤，制备得到衍生材料无论在生物活性还是免疫性方面均优于现有技术的效果，简化了制备工艺；
[0027](3)本发明所述的制备高活性生物衍生材料的方法，精心优化了超声步骤的操作频率参数，使得所述制备工艺在简化了有机溶剂脱脂步骤的前提下，依然取得了较为理想的技术效果，所得衍生材料的生物性能和免疫性能均更为理想。



[0028]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0029]图1是所述实施例1制备的生物衍生材料的HE染色图；
[0030]图2是现有技术制备SIS组织修复材料与实施例1制备的生物衍生材料植入大鼠后引起的周围组织炎性细胞统计数据柱状图。

[0031]实施例1
[0032]本实施例所述的生物衍生材料按照如下步骤制备:
[0033](1)取羊小肠用自来水进行冲洗，然后用0.1%的过氧乙酸与17%的乙醇混合水溶液处理羊小肠，再用纯化水冲洗干净；
[0034](2)手工刮除上述清洗、消毒后的羊小肠的肌层、浆膜层和粘膜层，得到所述粘膜下层4kg，将所述粘膜下层放入带有自动进排水功能的控温超声清洗机的清洗池中，交替用高渗透压盐溶液和纯化水水对所述粘膜下层在超声条件下进行振荡浸泡处理，所述超声浸泡步骤如下:将25L的浓度为4%的高渗透压氯化钠溶液排入控温超声清洗机的清洗池中，于20kHz的超声频率下超声浸泡处理所述粘膜下层，Imin后排出所述高渗透压氯化钠溶液，然后再向所述清洗池中排入25L的纯化水，于30kHz的超声频率下超声浸泡处理所述粘膜下层，20min后排出所述纯化水，所述粘膜下层按照上述超声浸泡处理步骤各重复循环操作6次；
[0035](3)将上述步骤所得的粘膜下层用0.3%的去垢剂Triton XlOO浸泡清洗，共处理6次，每次30min，然后用浓度为0.9%的生理盐水反复冲洗所述粘膜下层，将所得的粘膜下层冻干，待所述材料冷冻到_40°C以下后抽真空减压干燥，即得所述生物衍生材料。[0036]实施例2
[0037]本实施例所述的生物衍生材料按照如下步骤制备:
[0038]( I)取猪小肠用自来水进行冲洗,然后用3%过氧乙酸与15%的乙醇混合水溶液处理猪小肠粘膜下层，再用纯化水冲洗干净；
[0039](2)手工刮除上述清洗、消毒后的猪小肠粘膜下层，得到所述小肠粘膜下层5kg，将所述粘膜下层放入带有自动进排水功能的控温超声清洗机的清洗池中，交替用高渗透压氯化钠溶液和纯化水对所述粘膜下层在超声条件下进行振荡浸泡处理，所述超声浸泡步骤如下:将IOL的质量浓度为20%的高渗透压氯化钠溶液排入控温超声清洗机的清洗池中，于25kHz的超声频率下超声浸泡处理所述粘膜下层，5min后排出所述高渗透压氯化钠溶液，然后再向所述清洗池中排入IOL纯化水，于25kHz的超声频率下超声浸泡处理所述粘膜下层，5min后排出所述纯化水，所述粘膜下层按照上述超声浸泡处理步骤各重复循环操作6次；[0040](3)将上述步骤所得的粘膜下层用3%的去垢剂Triton X114浸泡清洗，共处理5次，每次20min，然后用浓度为0.9%的生理盐水反复冲洗所述粘膜下层，将所得的粘膜下层冻干，待所述材料冷冻到_40°C以下后抽真空减压干燥，即得所述生物衍生材料。
[0041]实施例3
[0042]本实施例所述的生物衍生材料按照如下步骤制备:
[0043]( I)取猪小肠用自来水进行冲洗，然后用3%过氧丙酸与15%的异丙醇混合水溶液处理猪小肠，再用纯化水冲洗干净；
[0044](2)手工刮除上述清洗、消毒后的猪小肠粘膜下层，得到所述小肠粘膜下层0.5kg，将所述小肠粘膜下层放入带有自动进排水功能的控温超声清洗机的清洗池中，交替用高渗透压氯化钠溶液和纯化水对所述粘膜下层在超声条件下进行振荡浸泡处理，所述超声浸泡步骤如下:将1.5L的浓度为30%的高渗透压氯化钠溶液排入控温超声清洗机的清洗池中，于30kHz的超声频率下超声浸泡处理所述小肠粘膜下层，20min后排出所述高渗透压氯化钠溶液，然后再向所述清洗池中排入1.5L纯化水，于IOkHz的超声频率下超声浸泡处理所述小肠粘膜下层，Imin后排出所述纯化水，所述小肠粘膜下层按照上述超声浸泡处理步骤各重复循环操作5次；
[0045](3)将上述步骤所得的小肠粘膜下层用0.5%的去垢剂十二烷基硫酸钠溶液浸泡清洗，共处理2次，每次15min，然后用浓度为0.9%的生理盐水反复冲洗所述粘膜下层，将所得的粘膜下层冻干，待所述材料冷冻到_40°C以下后抽真空减压干燥，即得所述生物衍生材料。
[0046]实施例4
[0047]本实施例所述的生物衍生材料按照如下步骤制备:
[0048]( I)取猪小肠用自来水进行冲洗，然后用0.1%的过氧化氢与0.1%的异丙醇混合水溶液处理猪小肠，再用纯化水冲洗干净；
[0049](2)手工刮除上述清洗、消毒后的猪小肠的肌层、浆膜层和粘膜层，得到所述粘膜下层1kg，将所述粘膜下层放入带有自动进排水功能的控温超声清洗机的清洗池中，交替用高渗透压氯化钠溶液和纯化水对所述粘膜下层在超声条件下进行振荡浸泡处理，所述超声浸泡步骤如下:将5L的质量浓度为5%的高渗透压氯化钠溶液排入控温超声清洗机的清洗池中，于IOkHz的超声频率下超声浸泡处理所述粘膜下层，IOmin后排出所述高渗透压氯化钠溶液，然后再向所述清洗池中排入5L纯化水，于30kHz的超声频率下超声浸泡处理所述粘膜下层，IOmin后排出所述纯化水，所述粘膜下层按照上述超声浸泡处理步骤各重复循环操作4次；
[0050](3)将上述步骤所得的粘膜下层用浓度为0.5%的去垢剂Triton XlOO浸泡清洗，反复处理I次，每次lOmin，然后用浓度为0.9%的生理盐水反复冲洗所述粘膜下层，将所得的粘膜下层材料进行冻干处理，待所述材料冷冻到_40°C以下后抽真空减压干燥，即得所述生物衍生材料。
[0051]实施例5
[0052]本实施例所述的生物衍生材料按照如下步骤制备:
[0053]( I)取羊小肠用自来水进行冲洗，然后用3%的过氧丙酸与0.1%的乙醇混合水溶液处理羊小肠，再用纯化水冲洗干净；
[0054](2)手工刮除上述清洗、消毒后的羊小肠的肌层、浆膜层和粘膜层，得到所述粘膜下层1.5kg，将所述粘膜下层放入带有自动进排水功能的控温超声清洗机的清洗池中，交替用高渗透压氯化钠溶液和纯化水对所述粘膜下层在超声条件下进行振荡浸泡处理，所述超声浸泡步骤如下:将3L的浓度为25%的高渗透压氯化钠溶液排入控温超声清洗机的清洗池中，于28kHz的超声频率下超声浸泡处理所述粘膜下层，15min后排出所述高渗透压氯化钠溶液，然后再向所述清洗池中排入3L纯化水，于15kHz的超声频率下超声浸泡处理所述粘膜下层，Imin后排出所述纯化水，所述粘膜下层按照上述超声浸泡处理步骤各重复循环操作5次；
[0055](3)将上述步骤所得的粘膜下层用0.1%的去垢剂十二烷基硫酸钠溶液浸泡清洗，共处理3次，每次13min，然后用浓度为0.9%的生理盐水反复冲洗所述粘膜下层，将所得的粘膜下层冻干，待所述材料冷冻到-40°C以下后抽真空减压干燥，即得所述生物衍生材料。
[0056]效果例
[0057]以下通过效果例更好地说明本发明制备的生物衍生材料与现有技术中制备的SIS组织修复材料具有基本相同的安全性和有效性，且本发明制备的生物衍生材料还最大程度保留了生物活性物质，进而获得了所述生物衍生材料对创面或组织的生物活性高的显著技术效果。
[0058]1.实验材料
[0059]实验材料:本发明实施例1制备的生物衍生材料和采用现有技术中专利文献CN101433735A中实施例1制备得到的SIS组织修复材料。
[0060]2.实验方法及结果
[0061]2.1安全性和有效性的检测
[0062]分别将本发明实施例1的生物衍生材料和专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料进行HE染色处理，所述HE染色处理步骤如下:将材料用梯度酒精下行入水，后用自来水和蒸馏水先后清洗，用0.5%苏木素处理后用自来水清洗，再用1%盐酸酒精分色后用自来水清洗，再用1/400的氨水促蓝后清洗，用1%伊红染色后用80%酒精分色，梯度酒精脱水，二甲苯透明后得到树脂封片。本发明实施例1制备的生物衍生材料的HE染色图见图1，说明本发明实施例1制备的生物衍生材料细胞脱除的比较干净，未见残留的完整细胞结构。
[0063]分别检测本发明实施例1的生物衍生材料和专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料中的DNA残存量，所述DNA含量检测方法如下:(1)将材料37°C下，用蛋白酶K消化144小时；(2)将消化液用离心30分钟；(3)将上清液用苯酚-氯仿-异戊醇溶液(25:24:1)抽提纯化；(4)再将抽提液离心30分钟，去除上层水溶液；(5)加入乙醇，并置于_20°C保存8小时以上；(6)真空脱水DNA样品；(7)在用IxTE缓冲液溶解DNA样品；
(8)配制2XPicoGreen试剂工作液:用PH=8.01 XTE，按1:200的比例稀释浓缩PicaGreen ；
(9)配置标准品溶液测试并获得浓度曲线，标定DNA含量曲线，激发光谱波长为485nm带宽20nm,发射光谱波长为530nm带宽25nm ； (10)测试样品荧光值，根据样品荧光值计算其DNA浓度，并换算DNA占材料总重的百分含量。检测得到,本发明实施例1的生物衍生材料的DNA含量为18.1±8.9ng/mg，而专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料中的DNA含量为44.7±10.4ng/mg，两者比较发现，本发明制备的生物衍生材料的供体细胞脱除的比较彻底，说明本发明所述方法能有效去除细胞，制备的生物衍生材料的抗原性较低，安全性高。[0064]分别将本发明实施例1的生物衍生材料和专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料植入健康SD大鼠中，所述植入试验方法如下:取20只雄性SD大鼠，3-4周龄，体重180-220g，麻醉后皮下植入专利文献CN101433735A中制备的材料，在对侧植入本发明制备的材料，每张材料Icm2，分别随机选取植入I周，2周，4周，8周后各5只大鼠处死，所述大鼠的病区用于炎性反应评价，取所述病区的周围组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，于每张切面随机采取6个视野照相，进行炎性细胞，包括单核细胞、多形核白细胞数目，通过数字图像分析系统计数处理，计算单位面积(mm2)炎性细胞密度，比较两组材料植入后引起周围组织炎性反应的情况，所述统计柱状图见图2，结果发现，植入4周内两组材料炎性反应都属于比较温和的炎性反应，炎性细胞密度略有不同但是没有统计学差异，8周后两组材料植入组织周围炎性反应已经几乎消失，并发现所述生物衍生材料几乎全部被组织吸收，且其诱导长出的自体新生组织与自体组织结构无明显界限且形态相似，不易区分，未见淋巴细胞浸润，未发现严重的炎症反应，说明本发明的生物衍生材料与现有技术制备的材料在安全性上没有差别。
[0065]2.2生物活性物质的测定
[0066]通过ELISA方法分别检测本发明实施例1的生物衍生材料和专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料的生长因子含量。ELISA测试方法主要步骤:在培养板中加入标准浓度的VEGF (ng/mL)和b_FGF (pg/mL)的标准品、专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料及本发明实施例1的生物衍生材料，然后向专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料及本发明实施例1的生物衍生材料中加入生物素，在各样品中加入酶标记液，混匀后37°C孵育lh，洗板5次，每次5min，再在各测试样中加入底物适量，混匀后37°C孵育15min，最后加入终止液，放入测试仪器进行检测。测定结果为，本发明实施例1的生物衍生材料中的生长因子VEGF含量为52.2±7.5ng/mg, bFGF含量为4.6±0.6pg/mg，而手工刮除后所述的小肠粘膜下层中的生长因子VEGF含量 70.7±15.9ng/mg，bFGF 含量 5.4± 1.7pg/mg。而专利文献 CN101433735A 中制备的SIS组织修复材料中的生长因子VEGF含量为27.4±6.lng/mg, bFGF含量为3.2±1.6pg/mg，手工刮除后所述的小肠粘膜下层中的生长因子VEGF含量75.4±25.3ng/mg, bFGF含量6.0±4.7pg/mg，说明专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料中的生长因子如VEGF含量、bFGF含量远远小于与手工刮除后所得的小肠粘膜下层中的上述生长因子含量，而本发明中所述生物衍生材料虽然比手工刮除后所得的小肠粘膜下层中的生长因子含量有所降低，但是相比专利文献CN101433735A中制备的SIS组织修复材料中的生长因子含量明显升高，更好的保留了小肠粘膜下层的生物活性。
[0067]3.结论
[0068]( I)本发明制备的生物衍生材料与现有技术中制备的SIS组织修复材料的安全性和有效性相当；
[0069](2)本发明制备的生物衍生材料中的生物活性物质含量远高于现有技术中制备的SIS组织修复材料中的生物活性物质含量。
[0070]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。