专利名称：脐带血间充质干细胞分离液及分离流程的制作方法国内、外分离脐带血干细胞方法常采用磁珠/流式细胞分选法、脐血库仪器/羟乙基淀粉沉淀法和密度梯度离心法。由于目的不同，各类方法有其自身特点。磁珠法或流式细胞分选法应用相应单克隆抗体分离得到较纯的细胞群体，但细胞收获率较低，适宜做分析及科研应用。脐血库分离干细胞常用羟乙基淀粉沉淀和仪器离心分离法，分离的细胞量大、 成分较多但混有大量红细胞，适用于大量分离、储存干细胞。密度梯度离心法采用Ficoll 分离液分离细胞，得到单个核细胞(Mononuclear cells, MNC)群。目前可查到I个美国专利(专利I)[1]和2个中国专利(专利2、专利3) [μ用密度梯度离心法分离MNC。专利I、 2所用分离液密度均为I. 077g/L，专利3所用分离液密度为I. 075g/L。这两个密度的分离液分离得到的实际上是一组包括淋巴细胞、单核细胞、间充质干细胞、造血干细胞及少量分叶核细胞在内的MNC群。因此，选择简单、实用、成本低廉的密度梯度离心法从脐带血中分离得到最大比例间充质干细胞，直接作临床应用或继续培养、扩增细胞是需要解决的主要技术问题。干细胞分离过程中的各种实验条件，如离心力、离心时间、分离液与稀释脐带血比例、温度、试剂准备等环节各家报道差别很大，更无客观和科学的标准。建立一套优化的最佳分离流程即标准操作流程是脐带血干细胞临床应用中亟待解决的方法学问题。
本发明的目的在于寻找一种密度梯度离心法分离脐带血干细胞的最佳分离液密度并建立一套分离流程。该密度分离液能分离出比例最高的间充质干细胞；对实验过程中的各种条件进行优选，建立相应配套流程；实验所用各种材料、试剂均为无菌无热源医用级产品，能够满足临床治疗级制备干细胞的需要。为解决上述问题本发明采用的技术方案如下一种新的人脐带血间充质干细胞分离液，其密度是I. 073±0. 001g/L。该分离液由 9%聚蔗糖与33. 9%泛影葡胺按26. 88份与10份配伍而成。其配法如下药用级聚鹿糖(polysucrose solution)干粉,分子量400 000,先用灭菌无热源蒸馏水配置成40 ± I % (w/v)水溶液，备用。应用时，用蒸馏水配置9%溶液。60%泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),结构式为3, 5-二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸I-去氧-甲氨基山梨醇(医用造影剂)。应用时取60%泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15. 38ml即为 33. 9%泛影葡胺。在室温(18 20°C)下，取9%聚蔗糖26. 88份、33. 9%泛影葡胺10份充分混匀，用波美比重计测混合液比重或适当调整两者体积，即得1.073±0. 001g/L脐带血间充质干细胞分离液。分装成IOOml/瓶，过滤除菌，室温避光保存。可用下列公式计算分离液密度或两者体积分离液比密=[9%聚蔗糖的比密X其体积+33. 9%泛影葡胺的比密X其体积]/二者的体积之和。一种优选的人脐带血间充质干细胞分离流程[4]:采用两步法分离脐带血间充质干细胞第一步，6%羟乙基淀粉沉淀红细胞；第二步，密度1.073g/L分离液分离间充质干细胞。第一步轻乙基淀粉沉淀红细胞。取枸橼酸钠抗凝脐血80 100ml,无菌操作加入500ml圆形沉降瓶中，加脐带血量2倍体积的PBS，充分混匀。加脐带血量2倍体积的医用6%中分子羟乙基淀粉130/0. 4氯化钠注射液，充分混匀，盖盖(不要盖紧)，20°C，静置 60mino第二步应用密度I. 073g/L分离液密度梯度离心法分离间充质干细胞。吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液，缓慢加至分离液液面上(上清液分离液为I : I)。置水平离心机上，4°C，离心力700g，离心30min。离心后用移液管伸到单个核细胞(云雾层混浊带)层，轻轻吸出，加入到PBS液中，4°C，洗涤细胞3遍。即得到脐带血间充质干细胞。取少量样品做细胞计数、检测细胞活性，完成质检和质控。本发明的分离液和分离流程可分离得到脐带血中最大比例的间充质干细胞，淋巴细胞和单核细胞比例很小，获得的细胞状态好、活力高。可直接应用于临床治疗或进一步培养、扩增。还可用于外周血、骨髓间充质干细胞细胞的分离提取。是目前密度梯度离心法中分离提取间充质干细胞的最优方法。本分离液所用材料、试剂均为医用级产品，便于储存， 无毒无热源，可产业化生产；所用方法为优化的流程，简单、易行，稳定性好，重复性好，可广泛推广应用。优于其它同类产品和方法。本发明分离液与其它密度分离液分离效果比较，及实验流程对比分析优化结果如下第一部分本发明分离液与其它密度分离液分离效果比较。I材料与方法I. I脐带血来源本院健康产妇脐血。产妇年龄24 35岁。检查无肝炎、梅毒、艾滋病及其他妊娠并发症。实验共使用脐血30份，每份80 120ml，无菌采集后3小时内处理。I. 2主要试剂和仪器设备PBS 缓冲液，6 % 羟乙基淀粉，CD34-PE, CD45-FITC, CD14-APC，CD90-FITC, CD3-PerCP，CD29-APC，CD73-PE，CD105-PE购自美国BD公司。9%聚蔗糖液购自上海试剂二厂，33. 9%泛影葡胺购自上海信谊制药厂。光学显微镜、生物安全柜、电子秤、pH计、离心机、 大容量移液枪、超纯水制造系统、流式细胞仪(BD公司)。I. 3三种密度的分离液配制方法同上。可得到密度为I. 073±0· 001 (本品)、1· 075±0. 001、I. 077±0. OOlg/ L 3种密度的分离液。I. 4羟乙基淀粉沉淀红细胞方法同上。I. 5密度梯度离心法分离单个核细胞分别用三种密度的分离液分离脐带血MNC，其它方法同上。MNC质量鉴定采用胎盼蓝拒染法检测细胞活性；计数盘法计数MNC总数。I. 6流式细胞仪检测单个核细胞纯度取100 μ I单个核细胞悬液(细胞密度约I X IO6)，加100 μ I FITC或PE标记的特异性荧光直标单抗，包括 CD34-PE，CD45-FITC，CD14-APC，CD3_PerCP，CD90-FITC，CD29-APC， ⑶73-PE，⑶105-PE。另一份加入荧光标记的无关单抗，作为同型对照样品，室温下避光反应 15 30min。加入500 μ I PBS重悬成单细胞悬液，流式细胞仪检测。2 结果2. I三种密度的分离液分离脐带血MNC总数及细胞活力比较三种分离液分离脐带血MNC的总数和细胞活力，如表I。表I.三种密度分离液分离脐血MNC总数及细胞存活率(η = 30)一种人脐带血间充质干细胞分离液及其分离流程。分离液由9％聚蔗糖与33.9％泛影葡胺按26.88∶10配伍而成，密度1.073±0.001g/L。两步法分离脐带血间充质干细胞流程第一步羟乙基淀粉沉淀红细胞。第二步密度1.073g/L分离液分离间充质干细胞。本发明分离液和分离流程可得到脐带血中最大比例的间充质干细胞，淋巴细胞和单核细胞比例很小，获得的细胞状态好、活力高。所用材料、试剂为医用级产品，无毒无热源，可产业化生产，便于储存。所用方法为优化的流程，稳定性、重复性好。还可用于人骨髓、外周血间充质干细胞的分离。是目前密度梯度离心法中分离提取间充质干细胞的最优方法，优于其它同类产品和方法。