专利名称：间充质系干细胞的导引剂和间充质系干细胞的导引方法作为尚未分化、并能够分化成各种组织细胞的干细胞，已知作为受精卵未分化的状态的细胞的胚胎干细胞(ES细胞)、作为已分化组织中所含有的尚未分化的状态的细胞的成体干细胞等。成体干细胞存在于体内的各种组织之中，作为成体干细胞，已知例如骨髓中存在的间充质系干细胞。 间充质系干细胞是指能够分化成骨骼、肌肉、脂肪等属于间充质系的细胞但尚未分化的细胞。此外，该细胞作为还能分化为神经细胞等外胚层性的细胞、肝细胞等内胚层性的细胞也为人们所知。并且，间充质系干细胞作为能通过在已失去功能的组织中分化成其组织细胞来恢复组织的功能的细胞受到关注。具体地说，例如来自骨髓的间充质系干细胞作为能够随着血流被导引而向有炎症的组织或者受到损伤的组织聚集，受到用于诱导分化的分化诱导剂的影响而向该组织细胞分化的细胞而受到关注。此外，一直以来，已知各种能使间充质系干细胞分化为各种组织细胞的分化诱导剂。例如已知含有作为血小板衍生生长因子(Platelet-DerivedGrowth Factor)的TOGF-BB、且能使间充质系干细胞分化为肌肉组织细胞的分化诱导剂等(专利文献I)。现有技术文献专利文献专利文献I :国际公开W02005/063967号小册子
发明要解决的课题然而，这种分化诱导剂虽然具有使间充质系干细胞分化为特定组织细胞的性能，但存在如下问题关于例如将随着血流在体内循环的来自骨髓的间充质系干细胞向体内特定组织导引等这样的、导引间充质系干细胞的性能，未必能满足。本发明的课题是，考虑上述的问题点，以提供能够导引间充质系干细胞的间充质系干细胞的导弓丨剂，并且提供通过所述导引剂来导引间充质系干细胞的间充质系干细胞的导引方法。用于解决课题的方法本发明所涉及的间充质系干细胞的导引剂的特征在于，含有选自菩提树提取物、牡丹皮提取物、粗糠柴提取物、儿茶钩藤提取物、舌岩白菜提取物和樱提取物中的至少I种。本发明所涉及的间充质系干细胞的导引方法的特征在于，通过上述导引剂来导引间充质系干细胞。发明的效果本发明的间充质系干细胞的导引剂具有能导引间充质系干细胞这样的效果。 图I是显示细胞导引试验中的情况的示意图。图2是显示使用实施例I的导引剂进行的细胞导引试验的结果的图。图3是显示使用实施例2的导引剂进行的细胞导引试验的结果的图。图4是显示使用实施例3的导引剂进行的细胞导引试验的结果的图。图5是显示使用实施例4的导引剂进行的细胞导引试验的结果的图。图6是显示使用实施例5的导引剂进行的细胞导引试验的结果的图。图7是显示使用实施例6的导引剂进行的细胞导引试验的结果的图。图8是显示使用阴性对照和阳性对照进行的细胞导引试验的结果的图。
干燥物换算是指换算成作为从提取液中除去提取溶剂后的残渣的干燥物的重量。接下来，对于本发明的间充质系干细胞的导引方法的实施方式进行说明。本实施方式的间充质系干细胞的导引方法，是通过上述间充质系干细胞的导引剂来导引间充质系干细胞的的方法。间充质系干细胞包含于间充质系组织的细胞中，不仅能分化为软骨、脂肪、肌肉等中胚层性组织的细胞，还能够向神经等外胚层性组织、肝脏等内胚层性组织的细胞分化。并且，作为所导引的间充质系干细胞，在能够比较容易地从骨髓采取的方面、已知在血液中也能存在的方面，优选为骨 髓间充质系干细胞。在上述间充质系干细胞的导引方法中,可以在体外(in vitro)、体内(invivo)或者原位(in situ)通过上述间充质系干细胞的导引剂来导引间充质系干细胞。具体地，例如在体外的间充质系干细胞的导引方法中，可以实施使用具备在厚度方向有贯通的微细孔的膜(membrane)的装置,在膜的一侧加入间充质系干细胞,另一侧加入上述间充质系干细胞的导弓丨剂，在规定的时间将间充质系干细胞导引到膜的另一侧的方法等。此外，例如在体外的间充质系干细胞的导引方法中，可以实施刮取接种在载玻片上的间充质系细胞的一部分，在刮取的部分加入包含上述间充质系干细胞的导引剂的培养基进行培养，从而向刮取部分导引间充质系干细胞的方法等。骨髓间充质系干细胞的导引程度可以通过确认刮取部分的间充质系干细胞的增殖来评价。此外，例如在体内的间充质系干细胞的导引方法中，可以实施将含有上述间充质系干细胞的导引剂的水性凝胶埋入普通小鼠的皮下，并向该小鼠的静脉中注入表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,以下也称为GFP)的小鼠的骨髓间充质系干细胞，以规定时间饲育小鼠，从而向凝胶中导引骨髓间充质系干细胞的方法等。骨髓间充质系干细胞的导引程度可通过测定凝胶中的荧光的强度来评价。此外，例如在体内的间充质系干细胞的导引方法中，可以实施在将表达GFP的小鼠的骨髓间充质系干细胞移植到创伤模型小鼠的骨髓的同时，向该小鼠的创伤部涂布上述间充质系干细胞的导引剂，从而向创伤部导引来自GFP小鼠的骨髓间充质系干细胞的方法等。骨髓间充质系干细胞的导引程度可通过测定创伤部的荧光的强度来评价。此外，例如在原位的间充质系干细胞的导引方法中，可以实施在特定组织中应用间充质系干细胞的导引剂，向该组织诱导骨髓间充质系干细胞的方法等。更具体地说，可以实施例如，在皮肤的表皮组织上应用上述间充质系干细胞的导引剂，来将血液中存在的骨髓间充质系干细胞向表皮组织导引的方法等。上述间充质系干细胞的导引方法，在原位的情况下也可适用于除人以外的动物。另外，在人中也可以非治疗地应用。此外，作为原位的导引方法中的特定组织，不仅可列举上述的表皮组织，还可列举肌肉组织、软骨组织、肝脏组织等各种组织。上述间充质系干细胞的导引方法中，可以将上述间充质系干细胞的导引剂稀释使用。作为用于稀释的液体不特别限定，例如，可以使用水、生理盐水、间充质系细胞的培养液等。使用间充质系干细胞的导引剂时，对将该导引剂稀释而成的稀释液中的提取物的浓度不特别限定，优选以干燥物换算为O. 00001 O. 05重量％，通过使提取物的浓度以干燥物换算为O. OOOOl重量％以上，具有导引间充质系干细胞的性能更优异的优点。此外，在可以得到对间充质系干细胞的毒性更低的稀释液的方面，提取物的浓度以干燥物换算优选为O. 05
重量％以下。具体地说，在上述间充质系干细胞的导引方法中，优选以干燥物换算为
O.00001 O. 01重量％的浓度使用含有菩提树提取物的导引剂，更优选以O. 0001 O. 01
重量％的浓度使用。此外，优选以干燥物换算为O. 00001 O. 01重量％的浓度使用含有牡丹皮提取物的导引剂，更优选以O. 0001 O. 01重量％的浓度使用。此外，优选以干燥物换算为O. 00001 O. 01重量％的浓度使用含有粗糠柴提取物的导引剂，更优选以O. 0001 O. 01重量％的浓度使用。 此外，优选以干燥物换算为O. 0001 O. 05重量％的浓度使用含有儿茶钩藤提取物的导弓丨剂，更优选以O. 001 O. 01重量％的浓度使用。此外，优选以干燥物换算为O. 00001 O. 01重量％的浓度使用含有舌岩白菜提取物的导引剂，更优选以O. 0001 O. 01重量％的浓度使用。此外，优选以干燥物换算为O. 0001 O. 05重量％的浓度使用含有染井吉野樱提取物等樱提取物的导引剂，更优选以O. 001 O. 01重量％的浓度使用。本实施方式的间充质系干细胞的导引剂及间充质系干细胞的导引方法如上所例示，但本发明不限于上述例示的间充质系干细胞的导引剂及间充质系干细胞的导引方法。此外，在本发明中，在不影响本发明效果的范围内也可采用在一般的间充质系干细胞的导引剂及间充质系干细胞的导引方法中采用的各种方式。实施例下面举实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限于这些实施例。首先，如下所示，通过调制各提取物来制造仅由各提取物组成的间充质系干细胞的导引剂。对于其详细进行说明。(实施例I)作为实施例I的菩提树提取物，调制心叶椴提取液。详细地，将心叶椴(Tilia.cordata Mill)的花干燥粉碎后，取IOOg加入50体积％的乙醇水溶液1L，在室温(20°C )下进行提取操作3天，再进行过滤处理。然后由过滤所得的液体通过减压干燥而获得干燥物，将该干燥物用1，3-丁二醇稀释而调制心叶椴提取液。该心叶椴提取液由通过减压干燥法除去提取溶剂后的干燥物重量计算，包含干燥物O. 45重量％。(实施例2)作为实施例2的牡丹皮提取物，调制牡丹皮提取液。详细地，将牡丹(Paeoniasuffruticosa Andrews)的根皮干燥粉碎后,取IOOg加入50体积％的乙醇水溶液1L,在室温(20°C )下进行提取操作3天，再进行过滤处理。然后由过滤所得的液体通过减压干燥而获得干燥物，将该干燥物用1，3-丁二醇稀释而调制牡丹皮提取液。该牡丹皮提取液由通过减压干燥法除去提取溶剂后的干燥物重量计算，包含干燥物O. 90重量％。(实施例3)作为实施例3的粗糠柴提取物，调制粗糠柴提取液。详细地，将粗糠柴(Mallotusphilippinensis Mueller-Argoviensis)的树皮干燥粉碎后，取200g加入50体积％的乙醇水溶液2L，在保持60 80°C的同时进行提取操作2天，再进行过滤处理。然后由过滤所得的液体通过减压干燥而获得干燥物，将该干燥物用1，3- 丁二醇稀释而调制粗糠柴提取液。该粗糠柴提取液由通过减压干燥法除去提取溶剂后的干燥物重量计算，包含干燥物O. 20
重量％。(实施例4)作为实施例4的儿茶钩藤提取物，调制儿茶钩藤提取液。详细地，将儿茶钩藤(Uncaria gambir Roxburgh)的叶和嫩枝干燥粉碎后,取IOOg加入50体积％的乙醇水溶液2L，在一边搅拌一边保持50 70°C的同时进行提取操作3小时，再进行过滤处理。然后由过滤所得的液体通过减压干燥而获得干燥物，将该干燥物用1，3- 丁二醇稀释而调制儿茶钩藤提取液。该儿茶钩藤提取液由通过减压干燥法除去提取溶剂后的干燥物重量计算，包含干燥物4. 10重量％。 (实施例5)作为实施例5的舌岩白菜提取物，调制舌岩白菜提取液。详细地，将舌岩白菜(Bergenia ligulata (Wall.) Engl.)的根茎干燥粉碎后，取200g加入50体积％的乙醇水溶液3kg，一边搅拌一边在50°C进行提取操作8小时，将粗提取物进行冷却、过滤操作后，进行浓缩，将浓缩液通过填充有合成吸附体(商品名“夕^ Y ^才> HP — 20”三菱化学社制)的柱。之后进行水洗，将以30体积％乙醇水溶液溶出的溶出液进行减压干燥，然后再溶解于1，3-丁二醇而调制舌岩白菜提取液。该舌岩白菜提取液由通过减压干燥法除去提取溶剂后的干燥物重量计算，包含干燥物O. 50重量％。(实施例6)作为实施例6的樱提取物，调制染井吉野樱提取液。详细地，将染井吉野樱(Prunus x yedoensis)的叶干燥粉碎后,取IOOg加入50体积％的乙醇水溶液1L, 一边搅拌一边在室温(20°C)下进行提取操作3天，再进行过滤处理。然后由过滤所得的液体通过减压干燥而获得干燥物，将该干燥物用1，3-丁二醇稀释而调制染井吉野樱提取液。该染井吉野樱提取液由通过减压干燥法除去提取溶剂后的干燥物重量计算，包含干燥物2. 00重量％。然后，使用调制的各提取物作为间充质系干细胞的导弓丨剂，通过细胞导引试验进行评价。图I为显示该评价方法的情况的示意图。以下参照图I对评价方法进行详细说明。〈细胞导引试验〉将各实施例的提取液分别按O. 01体积％。O. I体积％或I体积％进行稀释，从而调制试验用样本。稀释使用达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’ s Modified EagleMedium) [DMEM “FBS (-)，P/S (-) ” ]培养基。这里[]内的FBS表示10%胎牛血清，P/S是表示100单位的青霉素和lmg/mL的链霉素。此外，(_)的记号表示未配合。另一方面，作为阴性对照样本(以下也称为N. C.)，准备DMEM“FBS㈠，P/S㈠”，作为阳性对照样本(以下也称为P. C.)，准备20ng/mL PDGF-BB (血小板衍生生长因子PEPROTECH社制)。此外，将小鼠骨髓间充质系干细胞(以下也称为mMSC)培养至汇合并进行回收，用10%FBS/DMEM “P/S(_) ”以IxlO7个细胞/ml的浓度进行悬浮，准备细胞悬浮液。接下来准备趋化小室(Boyden chamber) (NeuroProbe社制)，该趋化小室具备多个独立的孔，如图1(a)所示，孔被膜M分割成上部孔P和下部孔Q。设定成各试验用样本的任一种与阴性对照样本和阳性对照样本能够在同一趋化小室中进行试验那样，在该趋化小室的各下部孔中分别加样各样本为28μ I。此外，作为趋化小室的膜，采用商品名“PolycarbonateMembranes” (NeuroProbe 社制，细孔尺寸为 8 μ m)。接着，向趋化小室的上部孔中接种上述细胞悬浮液各50μ 1，在37°C、5%C02的条件下培养4小时(参照图1(b))。培养4小时后，如图1(c)所示，使用附带的过滤器擦净器R剥去未移动的mMSC，仅将向膜的下侧移动的mMSC通过Diff-Quik染色法(使用Sysmex社制试剂盒)进行染色。然后，将染色像数字化后而输入电脑，为了将图像二进制化成黑白两色，以被染成蓝色部分变为白色的方式进行转换，然后使用图像编辑软件(商品名“Photoshop”)的功能测定各孔范围内的平均亮度。通过将阴性对照样本和阳性对照样本的亮度与各试验用样本的亮度进行比较，来评价各实施例的间充质系干细胞的导引剂的mMSC导引活性。
实施例I 6的评价结果分别示于图2 图7。此外，作为参考实验，改变阳性对照样本所使用的TOGF-BB浓度通过与上述同样的方法进行了细胞导引试验。其结果示于图8。产业可利用性本发明的间充质系干细胞的导引剂及间充质系干细胞的导引方法，例如，可以适合用于对各种组织的各间充质系干细胞，评价经过游走而聚集(被导引)的性能的差。此外，本发明的间充质系干细胞的导引剂及间充质系干细胞的导引方法，例如，可以适合在通过在体内的特定组织中注射或者涂布导引剂等来应用于体内的组织，为了在该组织中使间充质系干细胞向特定的组织分化，而将通过血流在体内循环的间充质系干细胞导引到特定组织使其聚集的方法中使用。符号说明P :上部孔，Q :下部孔，M :膜，R :过滤器擦净器


本发明的课题是提供能导引间充质系干细胞的间充质系干细胞导引剂。本发明提供含有选自菩提树提取物，牡丹皮提取物，粗糠柴提取物，儿茶钩藤提取物，舌岩白菜提取物到樱提取物这六群物质中至少1种物质的间充质系干细胞导引剂。