一种恢复间充质干细胞全能性的方法【技术领域】，尤其涉及一种恢复间充质干细胞全能性的方法。[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种成体干细胞，因其具有强大的增殖能力和多向分化潜能，免疫原性低，来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化等优点，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。尽管骨髓中间充质干细胞含量相对较多，但仅占0.001%~0.01%，难以满足细胞治疗的需要，故需要在体外分离纯化，培养扩增才能满足要求。但是，MSCs在体外扩增过程中衰老和向成骨细胞自主分化问题严重影响其治疗效果和使用安全性。[0003]保持MSCs原有特性的关键在于改进MSCs的培养条件。MSCs在体内是处在一种立体环境，因此，有人提出三维培养的设想。1998年，Qiu对鼠骨髓基质细胞进行三维培养，扫描电镜检测发现微载体cytodex-3表面大量细胞覆盖，并相互桥接在一起，组成了三维多细胞聚合物。聚合物中可见矿化结节，免疫组化染色可见碱性磷酸酶和I 型胶原(Qiu Q, Ducheyne P,Gao H, Ayyaswamy P.Formation and differentiationof three-dimensional rat marrow stromal cell culture on microcarriers in arotating-wall vessel.Tissue Eng.1998;4:19-34.)? Glowacki 用胶原海绵作为载体进行三维灌注培养，减少了代谢产物的聚集，结果发现细胞外基质含量提高，所培养的细胞活性和功能均加强(Glowacki J, Mizuno S，Greenberger JS.Perfusion enhancesfunctions of bone marrow stromal cells in three-dimensional culture.CellTransplant.1998;7:319-26.)。但cytodex-3和胶原海绵均为实心载体，比表面积较小，细胞难以大规模扩增。而大载体生物反应器能否用于MSCS的扩增培养，还有待于一些问题的顺利解决，如大孔微载体的研制、细胞与载体的粘附、贴壁细胞的洗脱等。[0004]目前的3D培养都不能满足目前细胞工程和基因工程对种子细胞量的需求而形成产业化，而且，3D培养是否从根本上恢复了 MSCs多能性目前尚未有研究。
[0005]本发明的一个目的是提供一种恢复间充质干细细胞全能性的方法。[0006]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0007]1)将全能性降低的离体间充质干细胞悬滴培养，得到悬滴培养后的细胞；
[0008]2)将所述悬滴培养后的细胞继续悬浮培养，实现恢复所述全能性降低的离体间充质干细胞全能性。
[0009]上述方法中，步骤1)中，所述全能性降低的离体间充质干细胞为将离体间充质干细胞经体外扩增得到的间充质干细胞。
[0010]其中，上述离体间充质干细胞可来源于任何人体或动物组织和体液，如胎盘、脐带、骨髓、脂肪和/或脐带血等，而且该离体间充质干细胞的全能性是完好的。[0011]上述全能性降低的离体间充质干细胞可为任何原因所致，如体外扩增培养所致，包括体外培养体系原因或传代等因素；本发明的实施例中，上述全能性降低是由体外扩增培养导致，具体为传代培养4-10代；所述传代培养具体采用贴壁培养的方式。
[0012]上述全能性降低的离体间充质干细胞的特征体现在:与离体间充质干细胞相比，细胞的体积变大、形状由梭形变成不规则形、胞质的透明度增高、自主向成骨细胞分化、干细胞相关基因0ct4、Sox2、Nanog表达量下降。
[0013]上述方法中，步骤I)中，
[0014]所述悬滴培养包括如下步骤:将所述全能性降低的离体间充质干细胞悬浮，得到细胞悬液；再将所述细胞悬液滴加在培养皿盖上，再将滴加后的盖倒置在培养皿底上，培养，得到悬滴即为悬滴培养后的细胞；所述细胞悬液的浓度具体为IO4-1O8个/mL。
[0015]在上述悬浮前还包括将所述全能性降低的离体间充质干细胞消化的步骤。
[0016]上述方法中，所述悬滴培养还包括如下步骤:在所述培养前，向所述培养皿底中加入防止悬滴干燥的水或溶液；所述溶液为浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS缓冲液、生理盐水、细胞培养液或其它缓冲液。
[0017]上述方法中，所述培养皿为细胞或细菌培养皿；所述细胞或细菌培养皿的材质具体为塑料或玻璃。
[0018]本发明的实施例中悬滴培养具体如下:
[0019]1)用消化液将全能性降低的离体间充质干细胞消化成单细胞悬液，用高糖的DMEM+10% (质量百分含量)胎牛血清悬浮，调整单细胞悬液中细胞浓度为IX IO6个/mL，得到单细胞悬液；
[0020]2)以每滴35 μ I (每滴的细胞数约为35000个细胞)的体积把上述细胞悬液均匀的滴加到直径9cm细菌培养皿(不贴壁的培养皿)的盖中，每个细菌培养皿盖悬滴滴数控制在40滴，再小心的把细菌培养皿盖倒转盖在装有IOml的PBS (浓度为0.01M、pH值为7.4)培养皿底上；置于培养箱内，静置悬滴培养36h,得到悬滴。
[0021]上述消化采用的消化液为将胰酶和EDTA溶于浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS缓冲液得到的溶液，其中胰酶在消化液中的终浓度为0.25% (质量百分含量)，EDTA在消化液中的终浓度为0.02% (质量百分含量)。
[0022]上述方法中，所述悬滴培养中悬浮采用的悬浮液和所述悬浮培养采用的培养基均为细胞培养基或含有如下I)-3)中至少一种组分的细胞培养基:
[0023]1)促进细胞生长组分:血清、生长因子、细胞因子、微量元素、激素、维生素、细胞信号通路抑制剂和/或激活剂；
[0024]2)助于细胞附着的组分:胶原、明胶、透明质酸、纤维素、硫酸软骨素、肽、甲壳素、聚乳酸和/或水凝胶；
[0025]3)抗病原体感染的组分:抗生素。
[0026]上述细胞培养基为培养间充质干细胞的培养基；所述培养间充质干细胞的培养基为含有胎牛血清的高糖DMEM培养基，具体按照如下方法制备:将胎牛血清与高糖DMEM培养基混合得到的细胞培养基，所述胎牛血清在所述细胞培养基中的浓度为10% (质量百分含量)。
[0027]上述方法中，所述悬滴培养的时间为2-110小时；具体为36h ；[0028]所述悬浮培养的时间为2-110小时；具体为24h ；
[0029]所述悬滴培养和所述悬浮培养的条件如下:氧浓度为0.1-50%, CO2浓度为1-15%，温度为30-40° C；
[0030]所述悬滴培养和所述悬浮培养均为静态培养或动态培养；所述动态培养的方式为搅拌、旋转或震荡。
[0031]上述方法中，恢复所述全能性降低的离体间充质干细胞全能性体现在减小所述全能性降低的离体间充质干细胞的体积、降低所述全能性降低的离体间充质干细胞S期的细胞数量、增强所述全能性降低的离体间充质干细胞的分化能力、增强所述全能性降低的离体间充质干细胞的克隆能力和/或提高所述全能性降低的离体间充质干细胞中与全能性相关基因表达；
[0032]所述与全能性相关基因为CCR1、CCR2、CX3CR、CD49b、CXCR4、0CT4、S0X2 和 / 或NANONG。
[0033]由上述的方法得到的间充质干细胞也是本发明保护的范围。
[0034]本发明的另一个目的是提供一种间充质干细细胞培养方法。
[0035]本发明提供的方法，包括上述的方法的步骤。
[0036]本发明的实验证明，本发明提供了一种恢复间充质干细胞全能性的方法，具体采用3D培养，将经过多次传代培养的间充质干细胞(全能性降低的间充质干细胞)经3D培养处理后，其增大的体积逐渐恢复、细胞活性增强、克隆能力和分化能力增强、其旁分泌作用也有所提高，这些结果说明`，此种3D培养的方法，使已经衰老的间充质干细胞重返年轻，恢复了干细胞特性；而且本方法采用一种可调控的无损伤的物理手段，体外调节人间充质干细胞的多能性及分化能力，实现了体外扩增间充质干细胞的维持和恢复，进而解决了人间充质干细胞的临床应用中的难题，具有较好的经济效益和社会效益。另外，全能性恢复的MSCs作为移植的种子细胞具有以下优点:具有极低的免疫原性，因而不会引起排斥反应；不涉及胚胎干细胞的伦理问题等等。



[0037]图1为贴壁培养的MSCs多能性降低
[0038]图2为3D培养的MSCs细胞球的形成
[0039]图3为3D培养的MSCs细胞大小形态的改变
[0040]图4为3D培养对细胞周期和凋亡的影响[0041 ]图5为3D培养对MSCs分化能力的影响
[0042]图6为3D培养对MSCs克隆能力的影响
[0043]图7为3D培养的MSCs全能性相关基因的表达

[0044]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046]下述实施例中离体间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)购自CyagenBiosciences Inc、产品目录号为HUXMA-01001,也可以按照如下方法制备:胰酶分离离体人骨髓、脐带或者胎盘间充质干细胞，然后收集细胞培养，当细胞达到70%-80%的融合时，用D-PBS清洗后，胰酶处理，然后加入完全培养基终止消化，吹打成单细胞悬液，离心去上清，完全培养基重悬后，传代培养。
[0047]下述实施例中细菌培养皿(不贴壁的培养皿)购自武汉致诚信达科技开发有限公司，产品目录号为T⑶000090。
[0048]下述实施例中的消化液为胰酶和EDTA溶于浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS缓冲液得到的溶液，其中胰酶在消化液中的终浓度为0.25% (质量百分含量)，EDTA在消化液中的终浓度为0.02% (质量百分含量)。
[0049]下述实施例中浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS缓冲液配方如下:NaCl 8.0Og,Na2HPO4.12H20 2.90g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.24g。
[0050]下述实施例中细胞培养条件可采用:氧浓度为0.1-50%, CO2浓度为1_15%，温度为30-40° C，具体均为氧浓度为10%，CO2浓度为2%，温度为37° C ;
[0051]实施例1、全能性降低间充质干细胞的获得
[0052]一、间充质干细胞的体外传代贴壁培养
[0053]将离体间充质干细胞(MSCs)在含有10%的胎牛血清(FBS，Gibco)的低糖DMEM培养基(Hyclone，SH30021.01B)中贴壁传代培养，每次传代培养的时间为3天，分别得到第1-10代贴壁MSCs。
[0054]二、贴壁培养后细胞全能性检测
[0055]I)、贴壁培养后MSCs的形态改变
[0056]将第I代和第10代培养MSCs细胞消化后接种在六孔板中培养过夜(12h)，第二天普通光学显微镜IOX物镜观察；结果如图1A-B所示，从结果中可以看出，第I代和第10代培养MSCs细胞消化后再培养分别得到第2代(p2)和第12 R(PII)MSCs细胞，随着传代次数的增多，细胞的体积开始变大，形状也由梭形开始变得不规则；从显微镜下观察，细胞在体积增大过程中，边界变的不明显，胞质的透明度增高。可以看出，贴壁MSCs的全能性降低。
[0057]采用同样的方法检测贴壁培养第4、6代的贴壁MSC，也出现体积增大，全能性降低的结果。
[0058]2)、贴壁培养的MSCs自主向成骨细胞分化
[0059]贴壁培养第4代的贴壁MSC进行碱性磷酸酶染色；结果如图1C显示，有少数细胞体积明显变平变大，并呈碱性磷酸酶染色阳性(红色)，呈现自主向成骨细胞的特征。可以看出，贴壁MSCs的全能性降低，不经诱导自主向一个方向成骨细胞分化。
[0060]米用同样的方法检测贴壁培养第6、10代的贴壁MSC,也出现自主向一个方向成骨细胞分化的结果。
[0061]3)、贴壁培养的MSCs全能性相关基因的表达
[0062]实时荧光定量PCR检验不同代次贴壁培养的MSCs中全能性基因0CT4、S0X2和NANONG的表达:其引物见后面表1。应用PrimeScript?RT reagent Kit (TaKaRa)试剂盒进行逆转录反应及用SYBR ? Premix Ex Taq? II(TaKaRa)试剂盒在ABI 7300QPCR仪器进行实时荧光定量PCR反应。逆转录反应:16° C,30min ；42° C,30s ；85° C，酶灭活5s;定时荧光定量反应:95° C预变性IOmin ;95° C变性15s;60° C退火60s，40个循环进行PCR扩增。GAPDH作为内参，Λ Λ Ct法相对定量。
[0063]部分实验结果如图1D显示，随着MSCs传代次数的增加，干细胞相关基因0ct4、Sox2、Nanog表达量都出现了不同程度的下降(第6代低于第2代)。
[0064]采用同样的方法检测第4、10代的贴壁MSC，表达量均低于第2代贴壁MSCs。
[0065]从上述结果可以看出，贴壁培养后，随着传代次数增多，MSCs的全能性逐渐降低。因此，与最初的离体间充质干细胞相比，第4代贴壁MSCs、第6代贴壁MSCs、第10代贴壁MSCs均为全能性降低的间充质干细胞。 [0066]实施例2、恢复间充质干细胞全能性的培养
[0067]将上述实施例1得到的全能性降低的间充质干细胞(第4代贴壁MSCs、第6代贴壁MSCs、第10代贴壁MSCs)分别进行如下两组处理:
[0068]A组:贴壁培养:培养方法同上，得到第5代贴壁MSCs、第7代贴壁MSCs、第11代贴壁MSCs。
[0069]B组:3D培养，培养方法如下:
[0070]1、悬滴培养
[0071]用消化液将第4代贴壁MSCs、第6代贴壁MSCs、第10代贴壁MSCs分别消化成单细胞悬液，用高糖的DMEM (GIBC0,C11995)+10% (质量百分含量)胎牛血清，调整单细胞悬液中细胞浓度为I X IO6个/mL，得到单细胞悬液；
[0072]以每滴35 μ I (每滴的细胞数约为35000个细胞)的体积把上述细胞悬液均匀的滴加到直径9cm细菌培养皿(不贴壁的培养皿)的盖中，每个细菌培养皿盖悬滴滴数控制在40滴，再小心的把细菌培养皿盖倒转盖在装有IOml的PBS(浓度为0.01M、pH值为7.4，sigma,货号:051M8311)培养皿底上；置于培养箱内，静置悬滴培养36h，得到悬滴。
[0073]2、悬浮培养
[0074]收集悬滴置于装有IOml培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清)的细菌培养皿继续静置悬浮培养24h，一共培养60h，得到第5代3D培养MSCs细胞球、第7代3D培养MSCs细胞球、第11代3D培养MSCs细胞球。
[0075]上述细胞球的形成过程如图2所示(以第5代MSCs细胞球为例)，A为悬滴培养4h ；B为悬滴培养12h ；C为悬滴培养24h ；D为悬滴培养36h ；E为悬滴培养48h ；F:10X物镜下细胞球的形态，可以看出，悬滴培养36h即可得到细胞球。
[0076]3、消化
[0077]将上述2得到的第5代3D培养MSCs细胞球、第7代3D培养MSCs细胞球、第11代3D培养MSCs细胞球分别经PBS洗两遍，用消化液消化lOmin，得到第5代、第7代和第11代3D培养MSCs细胞。
[0078]采用同样的方法消化第5代、第7代和第11代贴壁培养的MSCs，得到消化后第5代、第7代和第11代贴壁培养MSCs细胞。
[0079]三、检测3D培养后间充质干细胞的全能性
[0080]下述检测实验中的3D培养MSCs细胞和贴壁MSCs细胞均为消化后的细胞。
[0081]1、3D培养后MSCs生物形态学的改变
[0082]将第5代、第7代和第11代3D培养MSCs细胞分别接种在六孔板中培养过夜(12h)，第二天普通光学显微镜观察；以第5代、第7代和第11代贴壁MSCs细胞为对照。[0083]结果如图3所示，图3A为第11代贴壁MSCs细胞的结果；图38为第11代3D培养MSCs细胞结果；可以看出，3D培养细胞形态又开始恢复为梭形，体积变小，更具立体感。
[0084]图3C为第5代和第7代3D培养MSCs细胞、第5代和第7代贴壁MSCs前向反射角的大小比较；可以看出，与贴壁细胞相比，3D培养MSCs的第5代和第7代细胞的前向反射角变小，说明3D培养后细胞的体积减小(减少约42%)。
[0085]图3D为第5代贴壁MSCs的10 X物镜观察；图3E为第5代3D培养MSCs细胞的IOX物镜观察；可以看出，3D培养后细胞的体积明显减小。
[0086]2,3D培养MSCs的凋亡和细胞周期
[0087]将第5代贴壁MSCs和第5代3D培养MSCs细胞用PI(P_4170，sigma)染色30min，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。结果见图4A-B所示，A为第5代贴壁MSCs的细胞周期分布；B为第5代3D培养MSCs细胞的细胞周期分布；可以看出，经3D培养后，S期的细胞明显减少(贴壁培养:24.92% ；3D培养:3.73%)，细胞大部分处于静止期，从而维持了 MSCs的特性。
[0088]将第5 代贴壁 MSCs 和第 5 代 3D 培养 MSCs 细胞 Annexin V/PI (invitrogen,944090 )双染色Ih后，流式检测细胞凋亡。结果见图4C-D，C为第5代贴壁MSCs的细胞凋亡；D为第5代3D培养MSCs细胞的细胞凋亡；可以看出，3D培养后细胞的凋亡率为4.2%+0.7%，死亡细胞为3.3%，而大部分(91%)的细胞为活细胞；3D培养和贴壁培养的细胞的存活率无显著差异，说明3D培养不会降低细胞存活率。
[0089]3、3D培养的MSCs分化能力
[0090]I)、诱导3D培养`的MSCs成骨方向分化
[0091]成骨诱导培养:计数为5 X IO4个/ml第5代贴壁MSCs (贴壁)和计数为5 X IO4个/ml第5代3D培养MSCs细胞(3D培养)分别接种入六孔板中，细胞达到80%汇合后换成脂诱导培养液(10%胎牛血清、0.1 μ mol/L地塞米松、50 μ mol/L抗坏血酸、10mmol/L β -甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基)进行成骨诱导培养，每3天换一次液。以未进行诱导培养的为对照，加入的为常规培养液(含10%FBS的L-DMEM培养液)。
[0092]在诱导14d时各取各组细胞进行茜素红染色，光镜下观察并摄影，结果见图5A-D所示，其中，A为贴壁未诱导；B为3D培养未诱导；C为贴壁诱导；D为3D培养诱导；可以看出，未诱导，这两种细胞无显著差异；经过诱导后，3D培养的MSCs成骨分化的能力高于贴壁培养的MSCs。
[0093]2)、诱导3D培养的MSCs成脂肪分化
[0094]计数为5 X IO4个/ml的第5代贴壁MSCs (贴壁)和计数为5 X IO4个/ml的第5代3D培养MSCs细胞(3D培养)分别接种于培养皿中，细胞达到80%汇合后换成脂诱导培养液(L-DMEM培养液，10%FBS,地塞米松10_6mol/L，胰岛素10mg/L，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-1sobutyl-l-methylxanthine, IBMX) 0.Smmol /I,, Π引哚美辛 0.2mmol/L)进行脂肪诱导分化培养，每3天换一次液。以未进行诱导培养的为对照，加入的为常规培养液(含10%FBS的L-DMEM培养液)。
[0095]在诱导14d时各取各组细胞进行油红O染色，光镜下观察并摄影，结果见图5E-H所示，E为贴壁未诱导；F为3D培养未诱导；G为贴壁诱导；H为3D培养诱导；可以看出，未诱导，这两种细胞无显著差异；经过诱导后，3D培养的MSCs成脂肪分化的能力高于贴壁培养的MSCs。
[0096]4、3D培养的MSCs克隆能力检测
[0097]第5代贴壁MSCs (贴壁)和第5代3D培养MSCs细胞(3D培养)分别悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
[0098]将上述各组200个细胞分别接种含IOmL 37° C预温培养液(含10%FBS的L-DMEM培养液)的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37° C 5%C02及饱和湿度的细胞培养箱中培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，用PBS小心浸洗2次。加2ml4%多聚甲醛，固定细胞固定15分钟。去固定液，加适量结晶紫染液染30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率((克隆形成数/接种细胞数)*100%)。
[0099]结果如图6所示，A为蓝色线上方为贴壁培养的三个复孔的克隆，下方为3D培养的克隆数；B为贴壁培养和3D培养的克隆形成率(贴壁con的为19%，3D的为41%) ;C为IOX物镜下贴壁培养的克隆形态山为IOX物镜下3D培养的克隆形态，从上述结果可以看出，经3D培养后，MSCs的克隆数无论从数量还是质量上都有了显著的提高。
[0100]5,3D培养的MSCs全能性相关基因的表达
[0101]实时荧光定量PCR检验第5代贴壁MSCs (贴壁，con)和第5代3D培养MSCs细胞(3D培养)中迁徙相关基因CCRl、CCR2、CX3CR、CD49b、CXCR4、全能性基因0CT4、S0X2和NANONG的表达:其引物见表1。应用PrimeScript? RT reagent Kit (TaKaRa)试剂盒进行逆转录反应及用SYBR ? Premix Ex Taq? II(TaKaRa)试剂盒在ABI 7300QPCR仪器进行实时荧光定量PCR反应。逆转录 反应:16° C,30min ；42° C,30s ；85° C，酶灭活5s;定时荧光定量反应:95° C预变性IOmin ;95° C变性15s;60° C退火60s，40个循环进行PCR扩增。GAPDH作为内参，Δ Λ Ct法相对定量。
[0102]表1为全能性相关基因的引物
[0103]