专利名称:制备骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的方法及装置的制作方法管道组织损伤是临床上的常见问题,例如血管或胆管发生的管漏以及管道狭窄等。管道组织损伤修复方法很多一是改进外科手术技术,如外科手术显微镜下管道吻合, 减少吻合口狭窄和管漏;二是管道内支架植入技术。前者显微外科手术技术复杂、耗时,虽然可以降低管道并发症的产生,但是管道并发症仍可达5% 20%。后者最大的问题在于植入支架需经历再次创伤性操作取出,而且此类支架多为塑料或金属支架,与管道组织相容性差,易堵塞和引起逆行管道感染。因此,利用组织工程技术修复管道组织损伤将是最可行的治疗方法。利用基于干细胞和生物可降解材料支架复合的组织工程技术修复管道组织损伤时,不但可直接将受体管道套接于支架上,并且干细胞定向分化可促进修复管道组织损伤,生物可降解材料保证一定时间后可以自行降解。目前,对干细胞与可降解多孔材料支架进行复合的方法主要是采取对种植了干细胞后的支架进行灌流培养,通过这种灌流培养技术,达到干细胞在多孔材料支架内的均勻分布和快速生长。然而,如何在多孔材料管道支架内接种干细胞以及如何在灌流培养系统中立体灌流培养管道支架内的干细胞是制备干细胞-管道支架复合物的技术关键。
本发明提供一种有效地制备骨髓间充质干细胞在管道支架内均勻分布、生长良好、并具备一定力学强度的干细胞-管道支架复合物的方法及装置。本发明采用的技术方案是一种骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的制备方法,所述方法包括(1)细胞接种将供细胞立体培养的管道支架经消毒处理后,吸取第3代骨髓间充质干细胞的细胞悬液,均勻滴加至管道支架外表面,待吸收完全后将管道支架置于注射器内,负压抽吸2 5次;(2)静态培养将接种后的管道支架置于细胞培养装置中,添加干细胞培养液中静态培养20 30小时;(3)灌流培养静态培养结束后,将管道支架置于灌流培养槽中,所述灌流培养槽内径与所述管道支架外径相匹配,轴心位置设置有与所述管道支架中央通道相匹配的实心柱体,管道支架放置于柱体与外壁间的空腔内,空腔底部有供培养液流通的多孔底板;往灌流培养槽中通入干细胞培养液,在0. 1 0. 3mL/min流速下灌流培养10 15天,制备得到所述骨髓间充质干细胞-管道支架复合物。本发明关键在于灌流培养的过程,细胞接种和静态培养可按本领域常规方法进行。所述干细胞培养液为常规用于骨髓间充质干细胞体外培养的培养液,如DMEM、F12培养基等,本发明中选用添加10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的 α -MEM培养液。所述管道支架为常规用于组织工程修复管道组织损伤的生物可降解材料,如PEG、 PLLA、PLGA等,本发明中选用聚己内酯(PCL)管道支架,为中空管状结构,管壁为嵌合在一起的内外两层,管内壁为光滑致密结构,有利于提供一定力学强度和防止胆汁的外渗,管外壁为疏松的多孔结构,有利于干细胞的接种、粘附和生长,管外壁孔隙率90. 0% 95. 0%, 孑280 450 μ m。优选的,所述细胞悬液的细胞密度为2X IO6个/ml,配制细胞悬液的溶剂为添加 10% (ν/ν)胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养液。本发明还涉及一种灌流培养槽,由柱状槽体和上盖组成,所述柱状槽体与上盖可脱卸连接,上盖顶部设置有培养液进口,柱状槽体底部设置有培养液出口,所述柱状槽体轴心位置设置有实心柱体,所述柱体与外壁间形成供管道支架放置的空腔,空腔底部有供培养液流通并固定实心柱体的多孔底板。培养时培养液由上盖顶部的培养液进口进入空腔内,流经放置在空腔内的管道支架,然后由柱状槽体底部的培养液出口流出。本发明的有益效果主要体现在(1)本发明提供的灌流培养系统中灌流培养槽构造适合管道支架的装配,柱状槽体内中央的柱体可堵塞管道支架的内孔,以利于槽体经培养液进口流入的培养液能全部流经管道支架的管外壁孔隙,保证管道支架外壁孔隙内的细胞获得培养液营养;(2)本发明提供的灌流培养系统中灌流培养槽内径大小以及长度可调整,因此可以适用于多种细胞-管道支架复合物的制备,适合不同管道组织的受损后修复。(3)本发明可采用注射器多次真空处理的接种方法,提高了骨髓间充质干细胞在 PCL管道支架内的接种效率,并提高了细胞在管道支架外壁内的均勻分布和扩增能力,利用这种方法可获得骨髓间充质干细胞均勻以及高密度分布的复合管道支架,有望应用于临床上管道组织损伤的修复。图1为灌流培养装置示意图;图2为灌流培养槽结构示意图;其中A为灌流培养槽的纵剖图,B为柱状槽体底部的横截面;图3为荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在PCL管道支架横截面的分布情况;图4为荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在PCL管道支架外表面的分布情况;图5不同培养条件下PCL管道支架内骨髓间充质干细胞的细胞活力;图6为灌流培养条件下骨髓间充质干细胞在PCL管道支架上的增殖情况。取出上述细胞-管道支架复合物,用PBS洗3次后,将管道支架剪成小片后加入 ImlO. 5mg/ml的MTT工作液,37°C培养箱孵育4 5小时。然后将支架取出后,再将其继续剪碎后加入0. 8ml 二甲基亚砜(DMSO),振荡溶解,于8000r/min离心5分钟后,取上清液加于96孔板中检测,酶标仪于490nm处读取吸光值。取出细胞-管道支架复合物,PBS洗3次,于ddH20中保存于_20°C,待检。检测时,取出管道支架,室温融解,加细胞裂解液裂解30分钟,取裂解液50 μ 1加于96孔板,与 50 μ ITNE 缓冲液混合,再加入 100 μ 1 Hoechst33258 染色液(Sigma,上海,2X,2 μ g/ml), 室温孵育5分钟,多功能酶标仪(Infinite M200, Tecan, Austrilia)测荧光强度(Ex350nm/ Em450nm)。小牛胸腺DNA (Sigma,上海)作为标准品绘制标准曲线。依据上述实验结果,在构建基于骨髓间充质干细胞的组织工程产品时,以低流速进行的灌流培养是最适合的,既可以促进骨髓间充质干细胞的增值,又可以确保管道支架内的干细胞不会流失。结论(1)基于干细胞为基础的组织工程研究,本发明提供的配合灌流培养系统的灌流培养槽构造设计适合细胞-管道支架复合物的灌流培养。柱状槽体内中央的柱体可堵塞管道支架的中央通道(内孔),以利于上盖经培养液进口流入的培养液能全部流经管道支架的管外壁孔隙,保证管道支架外壁孔隙内的细胞获得培养液营养。(2)采用抽真空处理辅助均勻接种的方法在PCL管道支架上接种骨髓间充质干细胞,达到了较高的种子细胞接种效率以及细胞在管道支架管外壁内的均勻分布比较常用的自然渗透方法,采取真空处理辅助均勻滴种的方法接种的PCL管道支架中细胞分布明显比前种方法均勻很多。表明真空处理辅助均勻滴种的方法接种具有更好的接种效果。(3)在低流速灌流培养条件下,PCL管道支架上种子细胞的活力在培养后期明显高于静态培养对照组。同时,在低流速培养条件下,种子细胞能有效地黏附,细胞数量稳定增加。说明低流速灌流培养方法更有利于骨髓间充质干细胞在PCL管道支架内粘附、增殖和均勻分布。比较静态培养,低流速灌流培养有利于PCL管道支架内部种子细胞的存活和增殖,使得细胞分布均勻。
本发明提供了一种制备骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的方法及装置。本发明以柱状槽体内中央的柱体堵塞管道支架的中央通道(内孔),以利于上盖经培养液进口流入的培养液能全部流经管道支架的管外壁孔隙,保证管道支架外壁孔隙内的细胞获得培养液营养。本发明方法提高了骨髓间充质干细胞在PCL管道支架内的接种效率,并提高了细胞在管道支架外壁内的均匀分布和扩增能力,利用这种方法可获得骨髓间充质干细胞均匀以及高密度分布的复合管道支架,有望应用于临床上管道组织损伤的修复。
制备骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的方法及装置制作方法
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