一种生产高品质微藻生物柴油的方法[0002]微藻生物柴油作为石化柴油的替代品，就应该满足石化柴油的使用要求，即其理化性质应该与石化柴油接近，才能保证其燃料特性。衡量生物柴油性质的指标主要包括:密度、运动黏度、闪点、溜程、低温性能、残炭、灰分、十六烷值、甲醇含量、脂含量、磷含量、甘油含量、甘油含量、碘值和游离脂肪酸等，其中以十六烷值来评价生物柴油的燃烧性能。燃烧性能是生物柴油最重要的品质之一，而十六烷值主要是受原料的影响。此外，生物柴油生产原料中不饱和脂肪酸的种类和数量很大程度上决定了生物柴油产品的氧化稳定性。然而，微藻在培养的过程中，其脂肪酸含量和分布容易随环境条件改变而发生变化。如在一般的生长条件下，微藻积累的油脂相对较少，而在环境胁迫条件下，油脂的积累则可成倍增长。影响微藻油脂含量的因素有很多，例如化学因素、物理因素以及微藻自身的不同生长阶段等。目前，国内外对微藻生物柴油研究，主要集中在如何提高油脂含量和如何将油脂催化转化成生物柴油上，而在微藻的培养阶段，如何在提高油脂含量的基础上，同时也能改善油脂的品质方面几乎成为空白。
[0003]本发明的目的提供一种生产高品质微藻生物柴油的方法，其中以普通小球藻(Chlorella vulgaris)为藻种，采用双阶段培养，在培养的第一阶段，采用较温和的光照和光质、充足的营养及适宜的氮磷比、和适宜的温度等条件，目的促进微藻细胞的快速生长，在培养的第二阶段，采用高光照、氮缺乏和较高的温度条件，目的促进细胞油脂的积累和油脂品质的稳定和改善。`[0004]本发明通过以下技术方案进行实施:[0005](I)种子培养[0006]将装有普通小球藻Chlorella vulgaris的三角摇瓶接种至无菌光生物反应装置，在已灭好菌培养基中光照培养；光生物反应器系鼓泡式密闭反应器，包括CO2储气瓶、混气装置和气体流量计；种子培养基及培养条件如下:海盐24-34g/L，CH3COONa 0.3-0.5g/L, NaNO3 200-300mg/L, NaH2P0450_100mg/L，Na2EDTA I Omg/L, FeSO4.7H20 2.5-5.0mg/L,Vitamin B10.006-0.06mg/L, Vitamin B2 0.00005-0.0005mg/L，光源采用荧光灯或 LED，光照强度为8-lOKlux，光质为白光，初始pH为6.0-7.5，通气强度为0.2-0.7VVM，CO2浓度为0-0.5%，培养温度为23-26°C，培养3-5天，直到对数期，收集种子准备下一阶段发酵。[0007](2)种子收集
[0008]细胞收集采用离心或气浮等采集技术，以离心为例，在转速为4000-12000rmp情况下，常温下离心Ι-lOmin，得到藻泥后，并用清水清洗2-3次，再在同等条件下，离心得到的藻泥，然后，用少量的清水均匀重悬，即为后续发酵的种子。
[0009](3)第一阶段发酵
[0010]将准备好的种子接到装有发酵培养基的光生物反应器中，该反应器为室内开放式系统，包括CO2储气瓶、混气装置和气体流量计；该培养阶段的培养基及培养条件如下:海盐 28-34g/L，NaNO3 350-550mg/L, NaH2P0430-80mg/L, Na2EDTA 10_30mg/L, FeSO4.7H20 2.5-5.0mg/L, CuSO4.5H200.0lmg/L, ZnS04.7H20 0.03-0.06mg/L,CoCl2.6Η20 0.02-0.05mg/L,MnCl2 *4H20 0.2-0.6mg/L,Na2Mo4.2Η20 0.1-0.3mg/L, VitaminB10.006-0.06mg/L, Vitamin B2 0.00005-0.0005mg/L,生物素 0.00005-0.0005mg/L，其中氮磷元素之比为15-25最佳，光源采用荧光灯或LED灯，光照强度为8-lOKlux，光质为白光或蓝光，初始pH为6.0-7.5，通气强度为0.4-0.7VVM，CO2浓度为0.5-2.0%，培养温度为24-260C，培养至氮营养浓度降到零时，改变培养条件，即发酵进入第二阶段。
[0011](4)第二阶段发酵
[0012]通过增加灯光的数量或减小光源与光生物反应器之间的距离来增加光照，光质为白光或蓝光，光源采用LED灯或荧光灯，光照强度为30-70KluX，若为蓝光，光照强度采用6-10Klux，通气强度为0.4-0.7VVM, CO2浓度为0.5-2.0%，培养温度为27_30°C，待藻液变为淡黄色或藻内叶绿素大幅下降时，发酵结束。
[0013](5)微藻米收
[0014]采收可采用离心、化学絮凝和气浮等，以化学絮凝为例，絮凝剂采用硫酸铁、氯化铁、硫酸铝、氯化铝、壳聚糖等，将培养好的藻液收集在容器中，并向容器中按藻液比例加一定剂量的絮凝剂，如向藻液 中加于FeCl320-80mg/L，待絮凝完全，倾去上层水层，得到藻泥。
[0015](6)油脂提取
[0016]采用先破碎后提取的办法，破碎可采用酶法破碎、超声破碎和液氮破碎，其中酶法破碎的的酶涉及纤维素酶、中心蛋白酶、碱性蛋白酶、果胶酶、破壁酶、蜗牛酶和脂肪酶，酶法中以纤维素酶和蛋白酶共同破碎效果最好，在以上所有的破碎中，以液氮法和酶法效果最好；油脂提取采用有机萃取法，采用氯仿/甲醇/水按(1:1:1)体积或乙醚/正己烷/水按(I:1:1)体积常温萃取。
[0017](7)油脂分析
[0018]油脂采用GC-MS进行分析，取一定量的油脂加于2mL离心管中，再依次加于1.5mL的正己烷和0.2mL的0.4mol/L氢氧化钾甲醇溶液；摇匀，静置10分钟左右；取上清液0.5mL到1.5mL的离心管中，同时加入0.3mL的去离子水，摇匀后，再在4500rmp条件下，离心3min;最后，取适量上层正己烷层，用色谱纯的正己烷进行稀释，并加入无水硫酸钠，预处理结束，准备进样。色谱条件:Thermo Finnigan TRACE DSQ型气相色谱-质谱联用仪，采用DB-5MS 毛细管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m)。起始柱温 50°C，以 20°C /min 升温到 250°C，保持2min。进样温度200°C，载气为氦气，载气流速lml/min,不分流进样。总运行时间为12min。萃取头在进样口于200°C下脱附5min。质谱检测条件:EI源70eV，离子源温度2500C，传输线温度250°C，扫描范围50-400aum。
[0019](8)燃烧性能评价
[0020]燃烧性能以十六烷值(CN)来评价生物柴油的燃烧性能，CN值采用Lapuerta etal.(2009) and Tong et al.(2010)所提到的模型进行评估，评估模型如下:[0021]对于饱和脂肪酸:
[0022]CN=-107.71+31.126η_2.042η2+0.0499η3
[0023]对于单不饱和脂肪酸:
[0024]CN=109-9.292n+0.354n2
[0025]对于多不饱和脂肪酸:
[0026]CN=-21.157+ (7.965-1.785db+0.235db2) n_0.099n2
[0027]对于混合脂肪酸体系:
[0028]CN=L 068 Σ (CNiHii) _6.747
[0029]其中，η代表脂肪酸的碳原子数量数，db代表双键的数量。
[0030]此外，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例也是一个考核指标，代表生物柴油的氧化稳定性。
[0031]本发明方法中所用培养基的溶剂未明确标示时均采用去离子水作为溶剂。
[0032]本发明方法中pH调节方式:用lmol/L的硫酸和2mol/L的氢氧化钠调节pH。
[0033]本发明的有 益效果在于从微藻的培养条件和工艺两个方面着手，将藻体细胞的中油脂含量和优质品质两者分别优化处理，并整合处理，使用的两步光强光质法，操作简单，容易实现。本发明不仅能够提高油脂的产量，还能有效的改善油脂的品质，最终得到藻细胞的油脂含量在35%以上，CN值稳定在50以上，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例在
1.5-2.4，该发明从源头原料上有效的调节了生物柴油的产量和品质，满足了微藻生物柴油工业化的应用化要求，是一种较好的生产高品质微藻生物柴油的方法。

[0034]本发明提出一种从源头上生产高品质微藻生物柴油的方法，它在两步培养法的基础上，通过引入十六烷值，不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的比例等表征生物柴油品质的指标，来培养开始调控藻体的含油量和高油脂品质的藻体细胞，从未生产高质高量的生物柴油打下坚实的基础，为了帮助大家更好的理解本发明，特举实例如下:
[0035]实施例1:
[0036]本发明中藻种小球藻，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCCNO:M209256，其发酵培养基成分如下:
[0037]海盐28-34g/L，NaNO3 350_550mg/L，NaH2PO4 30_80mg/L，Na2EDTA10_30mg/L，FeSO4.7H20 2.5-5.0mg/L, CuSO4.5H20 0.0lmg/L, ZnS04.7H200.03-0.06mg/L, CoCl2.6H200.02-0.05mg/L, MnCl2.4H20 0.2-0.6mg/L, Na2Mo4.2H20 0.1-0.3mg/L, Vitamin B10.006-0.06mg/L, Vitamin B20.00005-0.0005mg/L,生物素 0.00005-0.0005mg/L，其中氮磷元素之比为15-25最佳；
[0038]第一阶段发酵条件:光质为白光，光照强度为8Klux，初始pH为7.0，通气强度为
0.5VVM，CO2浓度为1.0%，培养温度为25V ;培养至氮营养浓度降到零时，第一阶段发酵结束；
[0039]第二阶段发酵条件:光质为白光，光照强度为30Klux，通气强度为0.5VVM，CO2浓度为1.0%，培养温度为28°C，待藻液变为淡黄色或藻内叶绿素大幅下降时，发酵结束；油脂含量达到35%，CN值为50.5。[0040]实施例2:
[0041]第一阶段发酵条件:光质为蓝光，光照强度为6Klux，初始pH为7.0，通气强度为
0.5VVM，CO2浓度为1.0%，培养温度为25V ;培养至氮营养浓度降到零时，第一阶段发酵结束；
[0042]第二阶段发酵条件:光质为蓝光，光照强度为8Klux，通气强度为0.5VVM，CO2浓度为1.0%，培养温度为28°C，待藻液变为淡黄色或藻内叶绿素大幅下降时，发酵结束；油脂含量达到38%，CN值为52.1。
[0043]实施例3:
[0044]第一阶段发酵条件:光质为白光，光照强度为8Klux，初始pH为7.0，通气强度为
0.5VVM，CO2浓度为1.0%，培养温度为24°C ;培养至氮营养浓度降到零时，第一阶段发酵结束；
[0045]第二阶段发酵条件:光质为蓝光，光照强度为8Klux，通气强度为0.5VVM，CO2浓度为1.0%，培养温度为30°C，待藻液变为淡黄色或藻内叶绿素大幅下降时，发酵结束；油脂含量达到40%，CN值为50.1。