专利名称:一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法糖尿病是一种多病因引起、以高血糖为特征的内分泌代谢紊乱性疾病。高血糖是由胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者共同存在引起的。世界上,糖尿病患者已超过I. 7亿,已成为继心血管疾病和肿瘤之后第三大严重威胁人类健康的非传染性疾病。临床上,根据糖尿病发病机制不同,主要分为I型糖尿病(胰岛素依赖型)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型),我国以II型居多。治疗II型糖尿病的药物主要分为胰岛素及类似物如赖脯胰岛素等;促胰岛素分泌剂如磺酰脲类;胰岛素增敏剂如噻唑烷类衍生物;a -葡萄糖苷酶抑制剂等。 a -葡萄糖苷酶是一种在机体代谢过程中起关键作用的酶,与许多因代谢紊乱失调引起的疾病密切相关。a-葡萄糖苷酶主要由唾液和胰液中a-淀粉酶及小肠刷状缘上皮细胞上的麦芽糖酶、异麦芽糖酶、a -临界糊精酶、蔗糖酶和乳糖酶等组成。食物中的碳水化合物,如淀粉先经a-淀粉酶水解成麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖和a-临界糊精等,食物在口腔中停留时间短,所以该过程主要在小肠内进行。而后寡糖经小肠刷状缘上皮细胞上各种酶的作用生成葡萄糖及其他单糖,再经小肠黏膜细胞吸收而被机体利用。II型糖尿病患者因胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者的共同作用,血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细胞及在细胞内的氧化利用发生障碍,同时,肝糖输出增多导致高血糖。由于血糖水平超过肾小管吸收葡萄糖的能力,部分血糖随尿排出而形成糖尿病。因此,可以通过降低a -葡萄糖苷酶活性,限制或延缓碳水化合物在消化道内分解为糖类的速度,达到预防和治疗这类疾病的目的。a-葡萄糖苷酶抑制剂的结构类似寡糖,能够与寡糖竞争a-葡萄糖苷酶的结合位点,与a-葡萄糖苷酶结合,抑制酶的活性,减少寡糖分解,从而延缓肠道对单糖特别是葡萄糖吸收,避免了餐后可能发生的血糖过高。与胰岛素及其他口服降糖药相t匕,a -葡萄糖苷酶抑制剂的显著特点是能有效地阻止糖尿病患者餐后血糖升高,使血糖维持在一定水平。目前,国内外在a-葡萄糖苷酶抑制剂的研究方面,主要是以对硝基苯基- a -D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物,考察样品对a -葡萄糖苷酶的抑制情况。该方法只能得出样品是否有活性及抑制性的强弱,无法得到活性成分的结构信息。如果要得到具有抑制活性成分的结构信息,还需要进行反复的分离纯化,工艺复杂,且该方法不能高通量地检测活性成分。
有鉴于此,本发明提供一种筛选a-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。该方法根据受体-配体亲和反应原理,从备检样品中筛选到能够与受体a -葡萄糖苷酶结合的配体,经超滤、液相色谱-质谱联用技术检测,得到a-葡萄糖苷酶抑制剂。该方法灵敏度高、检测迅速、目标受体a-葡萄糖苷酶可以重复利用,适于高通量筛选a-葡萄糖苷酶抑制剂。为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案本发明提供了一种筛选a-葡萄糖苷酶抑制剂的方法,将备检样品与a-葡萄糖苷酶孵育,a-葡萄糖苷酶与备检样品中的活性成分发生亲和反应,通过截留分子量为IOOOODa的超滤薄膜,收集滤渣,经体积比为I : I的甲醇-水的混合溶液洗脱,超速离心后收集滤液,通过液相色谱-质谱联用技术进行分离鉴定。超滤和高效液相色谱-质谱技术联用主要是利用亲和原理,使备选样品中活性成分的混合物与a-葡萄糖苷酶混合,得到a-葡萄糖苷酶-活性成分复合物和未结合的小分子,通过超滤薄膜将未结合的小分子滤除后,上述复合物用有机溶剂处理,将活性成分释放出来,通过高效液相色谱-质谱联用技术,对这些活性成分进行分离和鉴别。 为了验证筛选得到的a -葡萄糖苷酶抑制剂对a _葡萄糖苷酶的抑制活性,本发明提供的方法还包括对a-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。将备检样品与a -葡萄糖苷酶孵育发生亲和反应时,可以将a -葡萄糖苷酶用pH值为6. 8的lOmmol/L的醋酸铵缓冲液配制成lOmmol/L的a -葡萄糖苷酶标准溶液。作为优选,备检样品可以包含天然产物提取物或中药复方提取物。优选地,备检样品可以选自黄连地黄提取物、刺五加叶提取物、银杏叶提取物、黄芩提取物。备检样品的制备可以取原料用乙醇溶液回流提取,合并提取液,浓缩得浸膏;称取上述浸膏用双蒸水悬浮,有机溶剂萃取,分离有机溶剂相和水相;合并水相备用;合并有机溶剂萃取物,蒸除其中的有机溶剂,得到干膏状有机溶剂相样品,备用;蒸除萃取后的水相部分中溶解的少量有机溶剂,用打孔树脂柱层析分离,依次用水和乙醇溶液为流动相洗脱,弃去水洗部分,蒸除乙醇溶液洗脱部分的溶剂,得干膏状样品备用;合并上述干膏状有机溶剂相样品盒干膏状样品,制得上述备检样品,发生亲和反应时,可以用PH值为6.8的10mmol/L的醋酸铵缓冲液稀释成10mmol/L或20mmol/L。作为优选,将过量备检样品与a -葡萄糖苷酶混合发生亲和反应。优选地,备检样品与a-葡萄糖苷酶的摩尔比为2 I。作为优选,孵育条件为在37°C下孵育15 30min。优选地,孵育条件为在37°C下孵育30min。作为优选,本发明中超速离心的条件为IOOOOg离心10 15min。作为优选,超滤、高速离心后,超滤薄膜用pH值为6. 8U0mmol/L的醋酸溶液离心清洗。优选地,超滤、高速离心后,超滤薄膜用pH值为6. 8、10mmol/L的醋酸溶液离心清洗三次,每次用70 IOOii L的lOmmol/L的醋酸溶液洗去未结合的小分子物质。作为优选,甲醇-水的混合溶液pH值为3. 3。优选地,用10mmol/L的醋酸溶液洗去未结合的小分子物质后,再向滤膜中加入70 IOOiiL甲醇-水的混合溶液,离心力为IOOOOg下离心10 15min,重复3次,收集滤液,冷冻干燥后用40 60 y L甲醇-水的混合溶液溶解,进行高效液相色谱-质谱联用测定。作为优选,在从备选样品黄连地黄提取物中筛选a -葡萄糖苷酶抑制剂时,高效液相色谱的检测条件可以为色谱柱DikmaDiamonsil C18 色谱柱(250mmX 4. 6mm, 5 u m);流动相乙臆(A)和水(B);梯度洗脱程序0 5min,15% A 20% A ;5 20min,20% A 25% A ;20 25min,25 ~ 90% A ;流速:0. 5mL/min ;进样量10u L0质谱的检测条件可以为采用正离子电离模式,扫描范围m/z 100-800,实验前质量数均经过校正。喷雾电压为5. OkV,金属加热毛细管温度250°C,金属毛细管电压5V,壳气流速50arbitrary,辅助气流速lOarbitrary。最大注入时间为200ms。作为优选,在从备选样品刺五加叶提取物中筛选a-葡萄糖苷酶抑制剂时,高效液相色谱的检测条件可以为 色谱柱DikmaDiamonsil C18色谱柱(250mmX4. 6mm, 5 u m);流动相乙臆(A)和0.5%醋酸(B);梯度洗脱程序t = Omin, 16% A(84% B) ;t = 0 14min, 16% A(84% B);t = 14 30min,16 40% A(84 60% B);柱温 28°C,流速0. 5mL/min ;进样量10y L。质谱的检测条件可以为电喷雾负离子模式,喷雾电压5. OkV,金属毛细管电压5V,金属毛细管加热温度230°C,壳气流速50arbitrary,辅助气流速lOarbitrary,扫描范围m/z 100 1000。作为优选,在从备选样品黄芩提取物中筛选a-葡萄糖苷酶抑制剂时,高效液相色谱的检测条件可以为色谱柱DikmaDiamonsil C18 色谱柱(250mmX4. 6mm, 5 u m);流动相(A) 0. 5%乙酸水溶液;(B)乙腈;梯度洗脱程序0 20min,15% A 15% B ;20 30min,15% 35% B ;30 40min,35% 60% B ;40 50min,60%~ 100% B ;流速:0. 5mL/min ;检测波长254nm ;进样量20u L0质谱的检测条件可以为Agilent RRLC-Q-TOF 6520质谱仪,采用负离子电离模式,扫描范围m/z 50 1500,实验前质量数均经过校正。干燥气温度350°C,气体流速8L/min,喷雾电压3500V。碰撞气电压20_55V。作为优选,在从备选样品银杏叶提取物中筛选a -葡萄糖苷酶抑制剂时,高效液相色谱的检测条件可以为色谱柱DikmaDiamonsil C18 色谱柱(250mmX4. 6mm, 5 u m);流动相(A) 0. 5%乙酸水溶液;⑶乙腈;梯度洗脱程序0 40min,17% 33% B ;40 90min,33% 50%B ;90 120min,50%~ 70% B ;流速:0. 5mL/min ;检测波长254nm ;进样量20u L0质谱的检测条件可以为采用负离子电离模式,扫描范围m/z 50 2000,实验前质量数均经过校正。喷雾电压为5. OkV,毛细管温度230°C,毛细管电压5V,壳气为N2,流速50arbitrary。本发明提供的筛选a-葡萄糖苷酶抑制剂的方法还包括设空白对照组,空白样品可以为不加a-葡萄糖苷酶,终浓度lOmmol/L的醋酸铵缓冲液。本发明还提供了药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、1,4-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、Oroxylin-A-7-0 Glu acid、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素A、槲皮素、芹黄素或山奈酚在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。本发明提供了一种筛选a -葡萄糖苷酶抑制剂的方法,利用亲和反应中配体-受体特异性结合的原理,采用超滤质谱联用技术,从天然产物提取物或中药复方提取物中筛选得到a-葡萄糖苷酶抑制剂,灵敏度高,每次分析仅需5 iimol的a-葡萄糖苷酶和备检样品中的活性成分;检测迅速,只需要很短时间就可以从备检样品中快速检测出a-葡萄糖苷酶抑制剂;目标受体a-葡萄糖苷酶可以重复利用;能够在一次试验中检测到多个a -葡萄糖苷酶抑制剂,适于高通量筛选a -葡萄糖苷酶抑制剂。
图I示实施例I中空白样品与黄连地黄提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中,峰3示药根碱,峰4示黄连碱,峰5示巴马汀,峰6示小檗碱。
图2示实施例I中a-葡萄糖苷酶样品与黄连地黄提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中,峰3示药根碱,峰4示黄连碱,峰5示巴马汀,峰6示小檗碱。图3示实施例I中筛选得到的a-葡萄糖苷酶抑制剂药根碱的质谱图。图4示实施例I中筛选得到的a-葡萄糖苷酶抑制剂黄连碱的质谱图。图5示实施例I中筛选得到的a -葡萄糖苷酶抑制剂巴马汀的质谱图。图6示实施例I中筛选得到的a-葡萄糖苷酶抑制剂小檗碱的质谱图。图7示实施例2中a -葡萄糖苷酶样品和空白样品分别与刺五加叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中,虚线示空白样品与刺五加叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图,实线示a-葡萄糖苷酶样品与刺五加叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。峰3示芦丁,峰5示金丝桃苷,峰6示异槲皮苷,峰7示1,4- 二咖啡酰奎宁酸,峰8示I,5- 二咖啡酰奎宁酸,峰10示斛皮苷,峰11示4,5- 二咖啡酰奎宁酸。图8示实施例2中筛选得到的a _葡萄糖苷酶抑制剂芦丁的质谱图。图9示实施例2中筛选得到的a _葡萄糖苷酶抑制剂金丝桃苷的质谱图。图10示实施例2中筛选得到的a-葡萄糖苷酶抑制剂异槲皮苷的质谱图。图11示实施例2中筛选得到的a -葡萄糖苷酶抑制剂1,4_ 二咖啡酰奎宁酸的质谱图。图12示实施例2中筛选得到的a -葡萄糖苷酶抑制剂1,5_ 二咖啡酰奎宁酸的质谱图。图13示实施例2中筛选得到的a-葡萄糖苷酶抑制剂斛皮苷的质谱图。图14示实施例2中筛选得到的a -葡萄糖苷酶抑制剂4,5_ 二咖啡酰奎宁酸的质谱图。图15示实施例3中a -葡萄糖苷酶样品和空白样品分别与黄芩提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中,虚线示空白样品与黄芩提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图,实线示a-葡萄糖苷酶样品与黄芩提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。峰I示黄芩苷,峰2示Oroxylin-A-7-0 Glu acid,峰3示汉黄芩苷,峰4示黄芩素,峰5示汉黄芩素,峰6示木蝴蝶素A。图16示实施例3中筛选得到的a _葡萄糖苷酶抑制剂黄芩苷的质谱图。图17示实施例3中筛选得到的a -葡萄糖苷酶抑制剂Oroxylin-A-7-0 Gluacid、汉黄芩苷的质谱图。图18示实施例3中筛选得到的a_葡萄糖苷酶抑制剂黄芩素的质谱图。图19示实施例3中筛选得到的a_葡萄糖苷酶抑制剂汉黄芩素、木蝴蝶素A的质谱图。图20示实施例4中a -葡萄糖苷酶样品和空白样品分别与银杏叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中,虚线示空白样品与银杏叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图,实线示a-葡萄糖苷酶样品与银杏叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。峰I示槲皮素,峰2示芹黄素,峰3示山奈酚。图21示实施例4中筛选得到的a-葡萄糖苷酶抑制剂槲皮素的质谱图。 图22示实施例4中筛选得到的a_葡萄糖苷酶抑制剂芹黄素的质谱图。图23示实施例4中筛选得到的a -葡萄糖苷酶抑制剂山奈酚的质谱图。
高效液相色谱的检测条件如下色谱柱DikmaDiamonsil C18色谱柱(250mmX 4. 6mm, 5 u m);流动相乙臆(A)和
0.5%醋酸(B);梯度洗脱程序t = Omin, 16% A(84% B) ;t = 0 14min, 16% A(84% B);t = 14 30min,16 40% A(84 60% B);柱温 28°C,流速0. 5mL/min ;进样量10y L。质谱条件如下电喷雾负离子模式,喷雾电压5. OkV,金属毛细管电压5V,金属毛细管加热温度230°C,壳气流速50arbitrary,辅助气流速lOarbitrary,扫描范围m/z 100 1000。刺五加叶提取物中a -葡萄糖苷酶抑制剂质谱鉴定信息见表I。表I刺五加叶提取物中a-葡萄糖苷酶抑制剂质谱鉴定
保留
峰UVXmax^
时间MSn(m/z)及相对丰度(%)化合物
号(nm)
(min)____
MS: 609(100)
MS2[609]: 301(100), 300(35)
312.53 254,353芦丁
MS3[609—301]: 179(100), 151(62),
____273(18),257(13),229(8),193(5)__MS: 463(100)
MS2[463]: 301(100), 300(40)
515.17 254,353金丝桃苷
MS3[463—301]: 179(100), 151(73),
____273(15),257(13),229(8),193(5)__
MS: 463(100)
MS2[463]: 301(100), 300(45)
616.32 254,353异槲皮苷
MS3[463—301]: 179(100), 151(75),
____273(15),257(13),229(6),193(6)__
本发明涉及分析化学领域,提供了一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。该方法将α-葡萄糖苷酶与备检样品孵育,通过超滤薄膜,收集滤渣,加入甲醇-水的混合溶液,超速离心后收集滤液,液相色谱-质谱联用技术分离鉴定得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。基于超滤质谱技术,本发明提供的方法灵敏度高、检测迅速、目标受体α-葡萄糖苷酶可以重复利用,适于高通量筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。
一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法
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