五味子总多糖在制备用于治疗咳嗽的药物或保健品中的应用的制作方法[0002]咳嗽是内科门诊最常见的症状，见于多种呼吸系统及非呼吸系统疾病。咳嗽本身是一种防御机制，清除气道内过多的分泌物及防止异物误吸入气道。但持续长时间的咳嗽却严重影响了患者的生活质量并造成患者严重的心理负担，同时也显著增加了个人及公共医疗卫生支出。[0003]按照病程来分，咳嗽包括急性咳嗽(〈3周)、亚急性咳嗽(3~8周)和慢性咳嗽(> 8周)。目前咳嗽的治疗一般都是采用中枢性镇咳药、周围性镇咳药及祛痰药等进行治疗，一般都能收到较好的疗效。但仍有部分急慢性咳嗽即使采用可待因等中枢性镇咳药物，咳嗽仍旧不能得到缓解，以致许多急性咳嗽发展成为慢性咳嗽，有的慢性咳嗽患者病程甚至达到几十年。[0004]多份国外流行病学研究显示慢性咳嗽在普通人群的发病率约9%~33%，2003年一项英国流行病学调查显示，慢性咳嗽在50~59岁的中年人发病率达12%，慢性咳嗽患者约占呼吸专科门诊患者的20%。近年随着大气环境污染的逐渐加重(如PM2.5,PMlO等)，慢性咳嗽的患病率还可能继续上升。目前的研究认为导致慢性咳嗽的主要病因包括:咳嗽变异性哮喘、嗜酸粒细胞性支气管炎、胃食管反流性咳嗽、上气道咳嗽综合征。对于上述病因引起的咳嗽，遵循咳嗽指南进行相应的治疗，大部分患者咳嗽可得到明显缓解。然而，仍有部分慢性咳嗽患者经过系列全面的检查后，未见明显异常，但咳嗽症状持续存在，既往称之为慢性特发性咳嗽(Chronic idiopathic cough, CIC)，其咳嗽症状治疗不佳，且无针对性病因治疗，是目前慢性咳嗽领域的难点及重点所在。有研究发现慢性特发性咳嗽以中年人多见，多以感冒为触发因素，此后咳嗽长期存在，通常对油烟、刺激性气味、冷空气、香烟烟雾等异常敏感，有时甚至大笑或讲话可诱发咳嗽，表现为咳嗽敏感性明显增高。针对此种情况，将咳嗽敏感性增高的慢性咳嗽称之为咳嗽高敏综合征(Cough hypersensitivitysyndrome, CHS)。咳嗽敏感性异常增高是慢性咳嗽高敏综合征患者共有的关键特征。[0005]目前对于咳嗽高敏综合征的患者，暂无合适的治疗手段可供选择，大多靠镇咳药物维持治疗。但镇咳药物，如可待因及右美沙芬等，存在着不同程度的副作用，如便秘、镇静、呼吸抑制等，因而限制了其使用，而且部分咳嗽高敏综合征的患者甚至使用中枢性镇咳药物，咳嗽亦不能缓解，严重影响日常生活质量。 [0006]五味子味酸、甘，性温。归肺、心、肾经。肺为娇脏，恶燥，五味子甘温而润，润肺止咳；久咳致肾不纳气，五味子味酸收敛，助肾纳气，治疗肺阴亏虚、肾不纳气所致久咳可谓功效极大。《本草会编》记 载:“劳嗽，宜用北者；风寒在肺，宜用南者”；《药品化义》记载五味子……能收敛肺气，主治虚劳久咳”；《本草求原》记载:“五味子，为咳嗽要药，凡风寒咳嗽、伤暑咳嗽、伤燥咳嗽、劳伤咳嗽、肾水虚咳、肾火虚咳、久咳喘促……皆用之”。张仲景明确指出:凡咳者均可加入五味子。《中华人民共和国药典》载其用于“久咳虚喘，……心悸失眠”。中医临床上五味子广泛用于咳嗽后期的干咳无痰或久咳不已的肺虚咳嗽病症。[0007]五味子的化学成分主要为挥发油类、木脂素类、三萜类、有机酸类及多糖类，其中联苯环辛烯木脂素类和降三萜内酯类成分是五味子属植物的特征性成分。五味子药理活性广泛，相关报道众多，尤其是其对肝脏的保护作用及宁心安神作用方面，研究较多。[0008]多糖类成分是五味子药材中的一类重要成分，含量在10%左右，据报道，五味子总多糖具有保肝、提高免疫力、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、降脂减肥、抗氧化等功效。但是，五味子总多糖作为五味子药材中含量极大的一类成分，一直未见关于其对咳嗽是否有缓解功效的文献报道。

[0009]本发明的目的在于提供五味子总多糖的新用途，具体在于提供五味子总多糖在制备治疗咳嗽的药物或保健品中的新用途。
[0010]进一步的，本发明提供五味子总多糖在制备用于治疗急性、亚急性或慢性咳嗽的药物或保健品中的新用途。
[0011]进一步的，本发明还提供五味子总多糖在制备用于镇咳、缓解咳嗽或消除气道炎症的药物或保健品中的应用。
[0012]所述五味子总多糖，是从五味子药材中提取得到的，用苯酚-硫酸法检测，其多糖类成分含量以D-葡萄糖计，为50%~100% (质量)。
[0013]所述的五味子可以是五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.(即北五味子)和/或华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.(即南五味子)。
[0014]所述五味子总多糖可制成药学上可接受的剂型，所述剂型例如但不限于片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、酊剂、口服液、糖浆、颗粒剂、丸剂或注射剂。本领域技术人员可以采用本【技术领域】的常规制剂工艺将五味子总多糖制成所需的剂型。例如，可采用现有工艺将五味子总多糖制成颗粒剂:取五味子总多糖，与辅料淀粉、蔗糖以及崩解剂混合后，加入用水溶解的粘合剂纤维素衍生物溶液进行混合，采用挤出制粒法将药物制成软粒，干燥，过筛，筛上物适当粉碎后再过筛，直至制成均匀颗粒，将制得的颗粒进行分装，每袋log。
[0015]本发明的五味子总多糖采用本【技术领域】现有的常规方法从五味子药材中提取得到，具体可以通过石油醚脱脂、水煎煮、乙醇沉淀、脱蛋白、脱色等步骤制成。
[0016]本发明针对咳嗽的临床治疗现状及难点，采用香烟烟雾刺激致咳嗽敏感性增高豚鼠模型及柠檬酸烟雾刺激致急性咳嗽豚鼠模型进行了实验，结果表明，五味子总多糖能显著延长香烟烟雾刺激致咳嗽敏感性增高豚鼠及柠檬酸烟雾刺激致急性咳嗽豚鼠的咳嗽潜伏期、减少咳嗽次数，显著减少香烟烟雾刺激致咳嗽敏感性增高豚鼠肺泡灌洗液中炎症细胞总数及中性粒细胞比例，病理切片观察提示五味子总多糖干预后豚鼠细支气管周炎症细胞浸润明显减少，管腔内渗出减轻，肺泡间隔增宽程度减轻，提示五味子总多糖对豚鼠的气道炎症具有显著的抑制作用。并且五味子总多糖的作用明显好于五味子水提取物，且呈一定量效关系，表现出镇咳、缓解咳嗽及消除气道炎症方面的应用前景。对于临床上咳嗽高敏患者，五味子总多糖具有制备成用于治疗这些患者的有效药物的应用前景。



[0017]图1，为实施例一豚鼠肺组织和气道病理切片代表图(HEX200)，
[0018]图2，为五味子总多糖不同时间点对柠檬酸烟雾刺激豚鼠咳嗽次数的影响。

[0019]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明并不限于此。
[0020]具体实施例中所用的实验动物:纯白Hartly豚鼠，普通级，雄性，体重300±50g，广东省实验动物中心提供(SCXK(粤)2008-0002)。豚鼠饲养在相对清洁、安静、恒温(23±3°C )、恒湿(55±15% )环境中，日夜周期为12:12小时/天,分笼饲养,5只/笼,可自由获得食物和水。
[0021 ] 具体实施例中所用的药物、试剂、及仪器:
[0022]I)五味子总多糖，其制备过程为:
[0023]将五味子药材粉碎，粉碎后用石油醚脱脂，然后用8倍量水煎煮3次，所得煎煮液进行浓缩，浓缩液用80%乙醇沉淀、过滤、沉淀酶法脱蛋白、活性炭脱色，用80%乙醇反复洗涤后进行干燥，得五味子总多糖，经检测，以D-葡萄糖计，其多糖含量为89% ； [0024]2)五味子水提取物，其制备过程为:
[0025]五味子药材粉碎一8倍量水煎煮2h，共煎煮3次一煎煮液浓缩，干燥一五味子水提取物；
[0026]3)0.9%氯化钠注射液:东莞普济药业有限公司。戊巴比妥钠:美国Merck公司。可待因:国药集团工业股份有限公司。“红玫”牌过滤嘴香烟:广州中烟工业有限公司。其它常规试剂:广州化学试剂厂。
[0027]4)实验仪器:PM型单腔非限制型小动物体描仪(1.0L):美国Buxco公司；数码摄影一体化系统:日本Nikon公司；0.6mX 0.6mX Im香烟烟雾染毒箱:本实验室自制；A1003电子天平:德国Satorius公司；MDF-U53V-80°C低温冰箱:日本三洋公司；3_18K SIGMA高速冷冻离心机:美国Beckman公司；22G静脉留置针:苏州医疗器械有限公司；AnkeTGL-16B型普通高速离心机:上海安停科学仪器厂；400型台式低温离心机:德国Heraeus公司；XW80A型旋涡振荡器:上海精密仪器仪表有限公司；DK8A恒温水浴锅:上海精宏试验仪器有限公司。
[0028]中所有数据用“均值土标准差”表示，各组间比较采用SPSS13.0进行单因素方差分析，方差齐用最小显著差异法(LSD)，方差不齐或非正态的数据采用秩和检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
[0029]实施例一:五味子总多糖对香烟烟雾刺激致咳嗽敏感性增高豚鼠的药理作用
[0030]1.1烟熏方法:豚鼠于实验前适应性安静饲养一周后，置于自制香烟染毒箱内，每次点燃10根香烟于烟熏槽内(烤烟型，焦油含量12mg，烟气烟碱含量1.lmg，烟气一氧化碳含量15mg)，通过三通阀将香烟烟雾打入染毒箱内，自香烟燃完开始计时。每次熏烟20分钟，每天熏烟2次，每二次熏烟间隔时间大于6小时，连续熏烟14天。
[0031]1.2 实验:[0032]豚鼠完全随机分成正常组、模型组、溶剂对照组(0.5(%的PEG400)、可待因组、水提取物高剂量组(剂量500mg/kg豚鼠/天，药物浓度50mg/mL)、总多糖高剂量组(剂量500mg/kg豚鼠/天，药物浓度50mg/mL)、总多糖中剂量组(剂量250mg/kg豚鼠/天,药物浓度25mg/mL)、总多糖低剂量组(剂量125mg/kg豚鼠/天,药物浓度12.5mg/mL)。
[0033]除正常组外，其余各组动物均采用上述1.1中的烟熏方法刺激。除正常组及可待因组外，其余各组豚鼠从烟熏第一天开始，于每天的第二次烟熏前2小时经口给予相应的药物或溶剂，连续14天。可待因组于柠檬酸咳嗽敏感性检查前I小时，经口给药(30mg/kg豚鼠，可待因浓度3mg/mL)。正常组正常饲养，不作任何处理。第15天将豚鼠置于体描箱内，适应2min后，雾化0.4mol/L柠檬酸水溶液进行咳嗽激发，IOmin后雾化结束，继续观察lOmin，记录自雾化开始的20min内豚鼠咳嗽次数及咳嗽潜伏期。
[0034]咳嗽激发实验24h后，3%戊巴比妥钠溶液(lmL/kg)腹腔注射麻醉动物，心脏取血10mL。取6mL0.lmol/L预冷的PBS缓冲液，分3次进行肺泡灌洗，统一灌洗左肺，每次反复灌洗3次,得肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)。将所得BALF震荡混悬，抽取0.5mL，用红细胞裂解液充分裂解，3000转/分钟离心10分钟，取10 μ L上清液滴入血细胞计数板，光学显微镜下计算BALF炎症细胞总数(细胞总数/mL=(四大格细胞总数/4) X IO 4/mL);抽取0.5mL后剩余的BALF于3000rpm离心10min,沉淀用ImLPBS混悬，取IOOyL制作细胞涂片，自然风干，浸泡于10%中性甲醛中过夜固定，取出后依次进行流水冲洗lOmin、苏木素染色15sec、流水冲洗lmin、I %盐酸酒精脱色2sec、流水冲洗lOmin、伊红染色5sec、流水冲洗lOmin、烘干，得中性树胶封片，光学显微镜下连续随机抽取20个400倍视野进行连续计数，每张涂片连续计数400个细胞，计算其中中性粒细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的比例。
[0035]豚鼠抽取BALF后，从心脏注入50mLPBS进行灌洗，从气管注入2.5mL4%多聚甲醛，然后剪取一块右下肺组织及 一段气管，10%中性甲醛固定24h以上。取出已固定好的肺组织，依次进行乙醇梯度脱水、生物透明剂处理、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、梯度酒精水化、双蒸水短暂漂洗，最后进行HE染色后，中性树胶封片，进行病理观察。
[0036]实验结果:与正常组比较，各实验组豚鼠气道阻力未见明显差异，提示本实验建模方法未造成豚鼠气道阻力增加，有别于慢性阻塞性肺疾病动物模型。
[0037]各实验组豚鼠柠檬酸激发咳嗽次数见表1。结果表明，与模型组比较，总多糖(高、中剂量组)均显示出显著减少咳嗽次数的活性，而低剂量对咳嗽次数的抑制虽未达统计学意义，但有减少的趋势，表现出一定的剂量相关性；与模型组比较，水提取物高剂量组豚鼠咳嗽次数无显著差异。
[0038]表1各实验组对香烟烟雾刺激致咳嗽敏感性增高模型豚鼠的咳嗽次数影响(.7±λ.) (η = 7 ~10)