专利名称：含有克拉夫定及阿德福韦酯的用于治疗慢性乙型肝炎的组合物的制作方法肝炎是指肝脏产生炎症，肝细胞受到破坏的状态。发生频率最高的病因为病毒感 染。在学术上，将病毒性肝炎中所占频率最高的乙型肝炎定义为病毒表面抗原(HBsAg)持续6个月以上的情况。乙型肝炎病毒(HBV，Ifepatitis B Virus)在细胞内感染后，发生复制，然后向血液内排出表面抗原和被称为包膜(envelope)抗原的HbeAg,以及保留了自身DNA的病毒体(virion)。因此，以上抗原被用作诊断肝炎的指标。急性肝炎，其在肝炎发生后的3-4个月内肝功能降低等临床症状会得到恢复或痊愈。与此相反，慢性肝炎的情况下，是指肝功能及组织检查中，肝炎持续6个月以上的状态，据报道慢性HBV携带者中的约25%会因原发性HCC或肝硬化而死亡。根据WHO (世界卫生组织)报告，乙型肝炎的慢性携带者约为4亿名，每年约有百万名以上因病死亡。尤其是20%的慢性肝炎患者在感染后的1(Γ20年期间转变为肝癌或肝硬化而死亡，70%的肝炎患者表现出了与乙型肝炎病毒感染的相关性，因此，切实需要开发出一种有效抑制病毒复制的治疗方法，以用于乙型肝炎的早期治疗。至今为止，已开发出的乙型肝炎治疗剂不能将HBV完全从体内消灭。此外，长期使用该种类药剂时，必然会产生对药剂有抗性的变异型HBV。核苷系列的I- (2’ -脱氧-2’ -氟-β-L-阿拉伯呋喃糖基)胸腺嘧啶(以下简称为克拉夫定)正在以Levovir的商品名销售,在给予克拉夫定时,会减少慢性乙型肝炎患者肝细胞内的cccDNA，因此，已知其具有以下优点。在给药结束后，也能够长时间地持续对病毒的抑制效果。作为抗病毒性药物的阿德福韦酯，根据化合物命名法命名的名称为9-[2_[双(新戊酰氧基)甲氧基]磷酰甲氧基]乙基-腺嘌呤，其作为逆转录酶抑制剂，对HIV及乙型肝炎病毒(HBV)显示出了优异的活体内抗病毒活性。上述物质的抗病毒活性可参照Barditch-Crovo P 等的《传染病杂志》，176 (2):406,1997 (J. Infect. Dis. , 176 (2):406,1997)及 Starrett 等的《地中海化学》，37 1857-1864 (1994) (J. Med. Chem.，37 :1857-1864(1994))。在自然状态下，已知阿德福韦酯具有无定形(amorphism)与结晶形(crystal)两种形态，阿德福韦酯通过水分水解，生成分解生成物质，因此，存在稳定性差的问题。为了解决这种稳定性问题，PCT专利申请(国际公开号W00035460A)中公开了更为稳定的阿德福韦酯药物组合物，其含有无水结晶性阿德福韦酯及二水合物结晶性阿德福韦酯及碱性赋形剂。为了对慢性乙型肝炎患者进行有效的长期治疗，需要抗病毒制剂的联合给药。这些HBV抗病毒制剂的最大的问题在于,给药一定时间后,会出现耐药病毒。一般，最广为人知的耐药病毒为耐拉米夫定病毒，相当于HBV聚合酶B区域部分的rtL180M变异和C区域部分的rtM204I/V变异。对患者给予拉米夫定的情况下，如果开始出现这种耐药病毒，会使血液中的病毒浓度增加，使得ALT/AST数值急速上升，患者的状态变得危险，因此需要使用对这些耐药病毒敏感的其它药物进行给药。至今，允许作为慢性乙型肝炎治疗剂销售的药物中，对耐拉米夫定病毒显示出效果的药物为阿德福韦酯。但阿德福韦酯在抗病毒效果方面，多少有些不尽如人意，在长期给药时，会出现对阿德福韦酯显示出耐药性的病毒，HBV聚合酶部分的rtA181V/T，rtN236T变异相当于此。因此，为了最大限度地抑制对特定药物显示出的耐药病毒的表达，并且有效地治疗慢性乙型肝炎，与其说是需要一种药物，倒不如说更需要的是对耐药病毒显示出相互抑制作用的药物的联合给药，并且对此非常重视。美国专利第6，528，515号中，作为治疗乙型肝炎病毒感染症的治疗方法，公开了一种对现有的乙型肝炎病毒具有抗病毒效果的药物的联合给药方法。作为一个例子，涉及 阿德福韦酯和克拉夫定的组合。并且，公开了以下内容这些药物组合的效果，在克拉夫定的相对浓度最高时(I: I摩尔比)最低，两个化合物的摩尔比为3:1时，获得最优异的整体相互作用。但是，这里只是例示了克拉夫定与阿德福韦酯的联合给药，并没有公开这些药物组合的效果或对相互作用所获得的效果进行支持的实验结果，而且完全没有涉及抗性变异病毒。对此，本发明人想要开发出一种新型的组合物，其通过HBV抗病毒制剂的联合给药，使乙型肝炎病毒感染病的治疗效果极大化的同时，尤其具有对耐药变异病毒的抑制作用。
技术问题本发明的目的在于，提供一种药物组合物，该药物组合物具有以下效果，使慢性乙型肝炎病毒感染病的治疗效果极大化，具有对耐药病毒的相互抑制作用。解决问题的方法为达成上述目的，本发明提供一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染病的组合物，其含有克拉夫定及阿德福韦酯。本发明中，制备了克拉夫定与阿德福韦酯的重量比为3:广1:1的制剂，该制剂的细胞效率试验结果表明，与单一制剂相比，克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂组合物，显著提高了乙型肝炎病毒感染病的治疗效果，并且随着提高组合物内克拉夫定的浓度，该效果更加显著。尤其是本发明的复合制剂组合物，对具有拉米夫定及阿德福韦酯抗性的变异病毒显示出了上升的效果，因此有助于说明本发明的组合物对变异病毒具有优异的抑制作用。本发明的克拉夫定及阿德福韦酯复合制剂，在用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染病的药剂学组合物的给药量，可以根据患者的年龄、症状、给药剂型或药物的种类而进行多种调整，克拉夫定优选为5 100mg，更有选为l(T30mg，阿德福韦酯优选为5 30mg，更有选为5 IOmg0此外，本发明的组合物可以使用药剂学中允许使用的通常的赋形剂等进行制备，为了获得高的生物药效率，可采用常规的制备方法。本发明的药学上允许使用的载体为可以和活性成分一起给药的有机或无机载体，包括用于固体药学制剂化的载体，例如赋形剂、润滑剂、粘合剂及崩解剂等。作为优选的赋形剂，例如有乳糖、白糖、D-甘露醇、D-山梨醇、玉米淀粉、糊精、结晶性纤维素、低取代性羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、阿拉伯胶、糊精、支链淀粉、轻质无水娃酸(lightanhydrous silicic acid)、合成娃酸招、娃酸招-镁等。作为优选的润滑剂，例如有硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、硅胶。作为优选的粘合齐U，例如有聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、玉米淀粉、蔗糖、谷蛋白、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶性纤维素、白糖、羟丙基纤维素及羟丙基甲基纤维素(HPMC)等。 作为优选的崩解剂，例如有羧基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、轻质无水硅酸及低取代羟丙基纤维素等。发明的效果本发明的克拉夫定及阿德福韦酯复合制剂组合物与单一制剂相比，具有以下效果，使乙型肝炎病毒感染病的治疗效果极大化，显示出对耐药病毒的相互抑制作用。图I是表示克拉夫定、阿德福韦酯，以及克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对HBV野生型病毒的抗病毒效果的DNA印迹杂交(Southern Hybridization)结果。图2是表示克拉夫定、阿德福韦酯，以及克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对HBV野生型病毒的抗病毒效果的磷屏成像仪(PhosphorImager)结果。图3是表示克拉夫定、阿德福韦酯，以及克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对源自患者的rtM204I变异病毒的抗病毒效果的DNA印迹杂交结果。图4是表示克拉夫定、阿德福韦酯，以及克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对源自患者的rtM204I变异病毒的抗病毒效果的磷屏成像仪结果。

使阿德福韦酯、克拉夫定、羧基乙酸淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮、D-甘露醇过18目筛并进行混合，使用水进行颗粒化后，进行干燥，以使得利用水分测定法(KF法)不超过2%。将干燥物过25目筛后，混合滑石粉和硬脂酸镁，使用8mm直径的平面圆形冲头直接压缩混合物，制得200mg片剂。实施例2 :含有克拉夫定及阿德福韦酯的片剂[成分含量]20mg克拉夫定IOmg阿德福韦酯IOmg羧基乙酸淀粉钠Img聚乙烯吡咯烷酮·152mg D-甘露醇5mg滑石粉2mg硬脂酸镁使阿德福韦酯、克拉夫定、羧基乙酸淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮、D-甘露醇过18目筛并进行混合，使用水进行颗粒化后，进行干燥，以使得利用水分测定法(KF法)不超过2%。将干燥物过25目筛后，混合滑石粉和硬脂酸镁，使用8mm直径的平面圆形冲头直接压缩混合物，制得200mg片剂。实施例3 :含有克拉夫定及阿德福韦酯的片剂[成分含量]IOmg克拉夫定IOmg阿德福韦酯IOmg羧基乙酸淀粉钠Img聚乙烯吡咯烷酮162mg D-甘露醇5mg滑石粉2mg硬脂酸镁使阿德福韦酯、克拉夫定、羧基乙酸淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮、D-甘露醇过18目筛并进行混合，使用水进行颗粒化后，进行干燥，以使得利用水分测定法(KF法)不超过2%。将干燥物过25目筛后，混合滑石粉和硬脂酸镁，使用8mm直径的平面圆形冲头直接压缩混合物，制得200mg片剂。效果试验例I :克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对HBV野生型病毒的抗病毒效果试验为了使对慢性乙型肝炎患者的治疗效果极大化，需要联合给予抗病毒制剂。为了确认本发明的克拉夫定和阿德福韦酯复合制剂的抗病毒效果，进行了如下试验。(I)病毒 DNA 的转染(Transfection)在转染约20-24小时前，将Huh-7细胞株在6孔板上以4X IO5细胞/孔的量放入，使其汇合(confluence)达到70 80%，并进行培养。在转化2小时前，从稳定化的细胞中去除培养液，以2mL/孔的量更换培养基，上述培养基为无血清培养基，并且为以克拉夫定、阿德福韦酯或克拉夫定/阿德福韦酯复合制剂各自的浓度稀释的培养基。然后，利用脂质体(lipofectamine,英杰公司(Invitrogen))进行转染，使得HVB野生型DNA每孔为2 μ g。药物处理浓度如下。克拉夫定为O. 9 μ M，阿德福韦酯为6. 3 μ Μ，复合制剂的情况下，使用克拉夫定与阿德福韦酯O. 9 μ Μ+6. 3 μ M或I. 8 μ Μ+6. 3 μ M同时进行处理。转染5小时后，替换为使用药物处理过的培养液，每24小时，使用药物处理的培养液进行更换。(2)细胞收集及HBV DNA分离转染后的第4天，使用冷的PBS清洗细胞后，进行收集。利用冷的羟乙基哌嗪乙磺酸细胞溶解(Hepes Lysis)缓冲液(1%NP_40)进行溶解，离心分离后，使用核酸酶(nuclease)处理上清液，从而去除转染的细胞DNA。使用26%PEG溶液，沉淀壳体(capsid)形态的核心蛋白。然后，使用O. 5%的SDS溶液及蛋白酶K (ProteinaseK)进行处理,从而去除壳体蛋白，分离壳体内部的HBV DNA。(3) DNA印迹杂交
将分离的HBV DNA在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，向带电阳性的尼龙膜进行毛细管转移(capillary transfer)。在转移的膜上，将标记32P-的凝胶-精制的整体_长度HBV片段进行杂化(Hybridization)，利用SSC缓冲液清洗后，在X射线薄膜上进行感光。利用磷屏成像仪测定了克拉夫定和阿德福韦酯复合制剂对克拉夫定单独或阿德福韦酯单独处理组的抗病毒效果。图I是表示克拉夫定、阿德福韦酯，以及克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对HBV野生型病毒的抗病毒效果的DNA印迹杂交(Southern Hybridization)结果，图2为磷屏成像仪结果。如图I和图2所示，本发明的阿德福韦酯和克拉夫定复合制剂与单一制剂相比，对HBV野生型病毒具有有效的抗病毒效果。具体地，将没有用药物进行处理的对照组的HBV野生型病毒复制率作为100%时，克拉夫定处理组、阿德福韦酯单独处理组中HBV野生型病毒复制率分别为65. 91%和55. 53%，使用上述两种药物同时处理的复合制剂的相对复制率为37. 44%。即，复合制剂处理组的HBV野生型病毒复制阻碍率为62. 56%，与克拉夫定单独处理组的34. 09%相比，显示出了约2倍的抗病毒效果，可以看出复合制剂对HBV野生型病毒的效果远远优于单独制剂。效果试验例2 :克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对HBV变异病毒的抗病毒效果试验如上所述，HBV抗病毒治疗剂的最大问题是给药一定时间后，会出现耐药病毒。一般最广为人知的耐药病毒为耐拉米夫定病毒，相当于HBV聚合酶B区域部分的rtL180M变异和C区域部分的rtM204I、rtM204V变异。作为耐阿德福韦酯病毒，HBV聚合酶部分的rtA181V、rtA181T，rtN236T变异相当于此。本发明利用一般最广为人知的对耐拉米夫定病毒有效的阿德福韦酯，与对耐阿德福韦酯病毒有效的克拉夫定，制备了复合制剂，按照下述方法，对本发明的复合制剂的耐药病毒的抗病毒效果进行了试验。(I)变异病毒克隆为了克隆具有耐拉米夫定病毒与耐阿德福韦酯病毒的HBV聚合酶部分变异的天然耐药物HBV病毒，从患者的血清中分离HBV DNACQIAmp MinElute病毒自旋试剂盒(QIAmpMinElute Virus Spin Kit) (QIAGEN公司)，用PCR法扩增HBV的逆转录酶部分，亚克隆到野生型整体基因表达载体上。使用试剂盒(爱思进(Axygen))对DNA进行了大量分离。
(2)病毒DNA转染在转染约20-24小时前，将Huh-7细胞株在6孔板上以4X IO5细胞/孔的量放入，使其汇合达到7(Γ80%，并进行培养。在转化2小时前，从稳定化的细胞中去除培养液，以2mL/孔的量更换培养基，上述培养基为无血清培养基，并且为以克拉夫定、阿德福韦酯或克拉夫定/阿德福韦酯复合制剂各自的浓度稀释的培养基。然后，利用脂质体(英杰公司(Invitrogen))进行转染，使得HVB野生型DNA每孔为2 μ g。药物处理浓度如下。克拉夫定为O. 9 μ M，阿德福韦酯为6. 3 μ Μ，复合制剂的情况下，使用克拉夫定与阿德福韦酯
O.9 μ Μ+6. 3 μ M或I. 8 μ Μ+6. 3 μ M同时进行处理。转染5小时后，替换为使用药物处理过的培养液，每24小时，使用药物处理的培养液进行更换。(3)细胞收集及HBV DNA分离转染后的第4天，使用冷的PBS清洗细胞后，进行收集。利用冷的羟乙基哌嗪乙磺 酸细胞溶解缓冲液(1%ΝΡ_40)进行溶解，离心分离后，使用核酸酶处理上清液，从而去除转染的细胞DNA。使用26%PEG溶液，沉淀壳体形态的核心蛋白。然后，使用O. 5%的SDS溶液及蛋白酶K进行处理，从而去除壳体蛋白，分离壳体内部的HBVDNA。(4) DNA印迹杂交将分离的HBV DNA在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，向带电阳性的尼龙膜进行毛细管转移。在转移的膜上，将标记32P-的凝胶-精制的整体-长度HBV片段进行杂化，利用SSC缓冲液清洗后，在X射线薄膜上进行感光。利用磷屏成像仪测定了克拉夫定和阿德福韦酯复合制剂对克拉夫定单独或阿德福韦酯单独处理组的抗病毒效果。图3是表示克拉夫定、阿德福韦酯，以及克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对源自患者的rtM204I变异病毒的抗病毒效果的DNA印迹杂交结果；图4为磷屏成像仪结果。如图3和图4所示，本发明的阿德福韦酯和克拉夫定复合制剂与单一制剂相比，对源自患者的rtM204I变异具有有效的抗病毒效果。具体地，将没有用药物进行处理的对照组的源自患者的rtM204I变异病毒复制率作为100%时，克拉夫定处理组、阿德福韦酯单独处理组中变异病毒复制率分别为87. 43%和31. 17%，使用上述两种药物同时处理的复合制剂的相对复制率为24. 49%。此外，将克拉夫定浓度增加两倍的复合制剂中，变异病毒复制率为13. 69%，显著减小。即，复合制剂处理组的变异病毒复制阻碍率为75. 51%或86. 31%，可以看出，复合制剂的效果远远优于已知的对变异病毒有效的阿德福韦酯单独处理组的68. 83%。效果试验例3 :克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对慢性乙型肝炎患者的抗病毒效果试验用于有效地治疗慢性乙型肝炎患者的两个药剂的联合治疗效果，虽然其作为可以应用于临床的新的治疗战略，但还没有关于克拉夫定与阿德福韦酯的复合制剂的研究。为了确认本发明的克拉夫定与阿德福韦酯复合制剂对慢性乙型肝炎患者的抗病毒效果，进行了以下试验。对慢性乙型肝炎患者的抗病毒效果试验对共40名的患者分为以下两组。一组为每日单独给予30mg克拉夫定的给药组，共给药24周(克拉夫定单独组；n=20)。另一组为每日联合给予30mg克拉夫定与IOmg阿德福韦酯，共给药12周后，停止阿德福韦酯给药，持续每天给予30mg克拉夫定的给药组(克拉夫定+阿德福韦酯联合组；n=20)。其结果为，在给药12周时，克拉夫定单独组的HBV DNA复制数为_2. 671ogl0复制(copies)/mL,克拉夫定+阿德福韦酯联合组为_4. IlloglO复制/mL,具有统计学显著性差异(p=0. 001)。在给药24周时，克拉夫定单独组为-4. 151ogl0复制/mL,克拉夫定+阿德福韦酯联合组为-4. 971ogl0复制/mL，具有统计学显著性差异(p=0. 036)。这说明在对慢性乙型肝炎患者进行初期治疗时，无交叉抗性的克拉夫定+阿德福韦酯复合制剂的给药比克拉夫定单独给药更能够强烈抑制HBV增殖。工业实用性本发明的克拉夫定及阿德福韦酯复合制剂组合物与单独制剂相比，具有以下效果，使乙型肝炎病毒感染病的治疗效果极大化，显示出对耐药病毒的相互抑制作用。因此尤其适合用于需要长期治疗的慢性乙型肝炎的治疗中。·


本发明涉及一种用于治疗慢性乙型肝炎的组合物，其含有克拉夫定及阿德福韦酯。本发明的复合制剂与单一成分的制剂相比，具有以下效果，使乙型肝炎病毒感染病的治疗效果极大化，显示出对耐药性病毒的相互抑制作用。