专利名称：一种具有保肝作用的中药有效部位复方制剂及其制备方法 现代医学对肝损伤的研究比较深入，已从多方面探讨了肝损伤的发生机制，并研制开发出了膜保护剂如磷脂和多不饱和卵磷脂等，抗氧化剂如还原型谷光肝肽等，抗免疫反应剂如calcineurin抑制剂等药物，但疗效尚难尽人意，且因其毒副作用，限制了临床应用。 五味子为常用中药，研究表明五味子有显著的保护肝功能的活性，其主要活性成分为联苯环辛烯型木脂素。五味子醇提取物及五味子甲素、乙素、丙素、醇甲、醇乙、酯甲、酯乙等成分对化学毒物引起的动物肝细胞损伤有显著的保护作用，可抑制转氨酶的释放，使ALT活性降低；明显诱导小鼠和大鼠肝微粒体细胞色素P-450活性，增加肝脏解毒能力。虽然，目前有文献研究表明五味子中的木脂素类成分是其保肝活性的主要成分，但是用常规方法得到的五味子提取物中木脂素类成分的含量不高，影响临床治疗效果。 黄芪为临床常用中药，具有抗炎、镇痛、强心、免疫促进等多方面的药理作用，是治疗肝炎、肾炎方剂中的主要药物。黄芪可保护肝脏粗面内质网，并使粗面内质网增加，增加细胞内rRNA和mRNA的含量，抑制核糖核酸酶活性，从而促进蛋白质合成，血清白蛋白(PA)、白蛋白(ALB)升高，丙氨酸转氨酶(ALT)下降，从而改善肝硬化患者肝脏蛋白质的合成功能，并能保护肝细胞膜，防治肝损伤。 我们通过研究后发现，五味子与黄芪配伍组成的中药复方对四氯化碳引起的肝损伤具有显著的保护作用。但传统中药复方存在着成分不清、机理不明、质量难控、疗效不稳的缺点。
本发明的目的在于提供一种由中药五味子和黄芪的有效部位组成的药物组合物，即现代中药复方制剂，其成分明确、质量易控、疗效可靠，可用于保护肝损伤，降低肝炎患者的转氨酶，并提出该中药复方制剂的制备方法。 本发明提出的中药有效部位复方制剂是由五味子中提取的五味子总木脂素和由黄芪中提取的黄芪总多糖为原料组配而成。
本发明药物组合物的原料药组成及配比如下 五味子总木脂素1-5重量份 黄芪总多糖0.5-6重量份 本发明组合物的制备方法为取五味子，用10倍量50-95％的乙醇加热回流提取3次，每次1.5-2小时，合并提取液，减压浓缩后，用25-30％乙醇稀释浓缩液，按照树脂量与药材量1∶1通过大孔树脂柱，即用10kg大孔树脂填充柱，先以4-6倍体积的30％乙醇洗脱，再以8-10倍体积的95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，60℃减压浓缩，烘干至恒重，即得五味子总木脂素；取黄芪，加10倍量的水回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度1.25-1.4g/ml，加入95％的乙醇进行沉淀，放置后，收集沉淀，反复纯化沉淀物，干燥，即得黄芪总多糖，或者提取液减压浓缩后，按照树脂量与药材量1∶1通过大孔树脂柱，即用10kg大孔树脂填充柱，再以12倍体积的水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩即得黄芪总多糖，将上述两种组分按配比混合均匀，最后经过常规工序直接或加入药学上可接受的赋型剂制成临床可接受的剂型。
所述剂型为注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂、缓释片、滴丸、冲剂、微粒剂。
所述赋型剂为各种制剂的常规辅料。
本发明药物组合物组合后使得各药物功效产生协同作用，明显改善四氯化碳所致小鼠肝损伤，对抗小鼠肝细胞坏死。
下面试验例用于进一步说明本发明。
试验例1 处方筛选试验 中药五味子性味酸、甘、温，归肺、心、肾经，功能收敛固涩、益气生津、补肾宁心，具有明显的保肝降酶作用，其主要活性成分为木脂素。但单独使用效果不理想，我们以中医药基本理论为指导，结合现代药理，采用四氯化碳急性肝损伤小鼠模型，以小鼠肝组织病理切片的变化和血清T-BIL、D-BIL、TP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST的活性为指标，观察五味子与大黄、丹参、黄芪、白芍、沙苑子、柴胡、菟丝子、蛇床子等药材配伍后的保肝、降酶作用。
1、实验材料 1.1药物 (1)受试药物 五味子、黄芪、大黄、丹参、白芍、沙苑子、柴胡、菟丝子、蛇床子提取物。提取方法如下。
五味子取药材干燥粗粉，以10倍量95％乙醇超声提取2次，每次1h，过滤，滤液浓缩备用。
大黄以5倍量75％乙醇超声提取2次，每次1h，过滤，滤液浓缩备用。
丹参以10倍量95％乙醇，超声提取2次，每次1h，过滤，滤液浓缩备用。
黄芪8倍量水，65℃回流提取2次，1.5h+1h，浓缩至5倍量后加2倍量95％乙醇沉淀，取沉淀物备用，经化学成分分析该沉淀物主要为黄芪多糖类成分。
柴胡80％乙醇，10倍量，超声提取2次，每次1h，过滤，滤液浓缩备用。
沙苑子10倍量石油醚超声30分钟+15分钟两次，滤去石油醚，药渣挥去石油醚，以10倍量60％乙醇，超声提取2次，每次1h，过滤，滤液浓缩备用。
蛇床子95％乙醇，10倍量，超声提取2次，每次1h，过滤，滤液浓缩备用。
白芍10倍量70％乙醇，超声提取2次，每次1h，过滤，滤液浓缩备用。
菟丝子95％乙醇，10倍量，超声提取2次，每次1h，过滤，滤液浓缩备用。
五味子临床剂量按2005版药典规定6g计，动物灌胃剂量以临床剂量的10倍计。各提取物与五味子提取物配伍均按生药1∶1比例计，用蒸馏水配成10％的浓度，五味子提取物配成5％的浓度，低温保存备用。
(2)阳性药物 联苯双酯滴丸浙江医药股份有限公司新昌制药厂生产，产品批号050910。动物按150mg/kg.d-1，用蒸馏水配成0.75％的浓度，低温保存备用。
1.2动物 ICR小鼠雌雄各半，体重18-20g，由第二军医大学实验动物研究中心提供。合格证号SCXK(沪)2002-0006 1.3仪器与试剂 仪器日本岛津全自动血液生化分析仪。
试剂四氯化碳溶液，以菜籽油配成1％浓度备用。
2、实验方法 取ICR小鼠120只，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、阳性组、五味子组、五味子+黄芪组、五味子+大黄组、五味子+丹参组、五味子+白芍组、五味子+沙苑子组、五味子+柴胡组、五味子+菟丝子组、五味子+蛇床子组，每组10只。按组分别灌胃蒸馏水、蒸馏水、联苯双酯及相应受试药物20ml/kg.d-1，连续7d。第7天，灌胃后1h，除空白对照组外，按组分别腹腔注射1％四氯化碳溶液10ml/kg。禁食16h后，摘眼球取血，以3000r/min离心15min，分离血清，测定血清中总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸转移酶(AST)。实验结果采用SPSS11.0统计软件单因素方差分析处理。
3、实验结果 模型组小鼠造模后16小时，血清T-BIL、D-BIL、ALT、AST明显升高，A/G明显降低，与空白组比较有显著性差异。连续预防给药7天后，五味子组D-BIL、ALT、AST，五味子+黄芪组T-BIL、D-BIL、TP、GLB、ALT、AST，五味子+柴胡组ALT、AST，五味子+白芍组D-BIL，五味子+丹参组T-BIL、ALT，五味子+蛇床子组ALT、AST，五味子+沙苑子组T-BIL、D-BIL、TP，五味子+大黄组ALT、AST，五味子+菟丝子组T-BIL、D-BIL、ALT、AST明显降低；五味子+白芍组TP、ALB，五味子+黄芪组A/G明显升高；与模型组比较有显著性差异。与五味子组比较，五味子+黄芪组T-BIL、GLB、AST明显降低，A/G明显升高；五味子+白芍组TP、ALB升高；五味子+大黄组ALB升高；差异有显著性。结果详见表1。
表1 五味子及其与其它药物配伍后对四氯化碳肝损伤小鼠肝 功能的影响(X±SD) 注与空白组比较，△P＜0.05，△△△P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与五味子组比较，▲P＜0.05，▲▲▲P＜0.001。
五味子组及五味子各配伍组均有不同程度改善小鼠肝功能的作用，对ALT和AST作用尤其明显。各给药组中，五味子+黄芪组作用最显著。结果提示，五味子+黄芪组改善肝功能综合作用较五味子组及其他配伍组为最优。
试验例2 提取工艺的研究 1提取溶剂对木脂素类化合物提取效率的影响 五味子药材10g，分别用水、10％，30％，50％，70％和95％的乙醇加热回流提取2次，每次2小时，提取液合并后，减压浓缩，定容至50ml容量瓶中，以HPLC法测定其中木脂素类化合物的含量。
从表2可知，随着乙醇浓度的增加，提取溶剂极性越小，五味子中木脂素类成分的提取效率越高。
表2 提取溶剂对五味子木脂素类化合物提取效率的影响 2正交试验 2.1正交试验设计 本处方中药材的主要成分多为较小极性的成分，提取工艺采用乙醇回流提取，并对溶剂量、溶剂乙醇浓度、提取时间和提取次数等四因素对提取效果的影响进行考察。本实验以样品中的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量大小作为提取效果的考察指标。我们选择正交试验四因素三水平进行正交试验。
实验方案如表3。
表3 L9(34)正交试验方案表 2.2正交试验结果 以五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素为指标正交试验分析结果如表4所示，含量依次为八＞四＞九＞六＞二＞七＞三＞五＞一，因素影响大小为A＞D＞C＞B，即乙醇浓度＞提取次数＞提取时间＞溶剂量，各因素最佳水平为A3B3C2D3，即10倍量90％乙醇提取3次，每次1.5小时。
表4 以五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素为指标的正交试验分析结果 3五味子总木脂素的纯化 将五味子药材用10倍量90％乙醇提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩成稠浸膏，用30％的乙醇悬浮浸膏，使每毫升相当于约1g五味子药材，将提取液通过AB-8大孔树脂柱，再分别用30％、50％、70％和95％的乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，减压浓缩，并烘干至恒重，以HPLC法测定各部分中五味子木脂素类成分的含量。
如表5所示，五味子木脂素类成分主要存在于50％、70％和95％的乙醇洗脱部分中。
表5 五味子木脂素类成分在不同浓度乙醇中的分布 根据上述结果，我们确定五味子中木脂素类化合物的纯化方法为五味子提取液通过AB-8大孔树脂柱，先用30％的乙醇进行洗脱，接着用95％乙醇进行洗脱，95％乙醇洗脱部分减压浓缩，烘干至恒重，即为五味子总木脂素。结果见表6，其中木脂素类成分含量为54.34％ 表6 五味子木脂素类成分在不同浓度乙醇中的分布 4黄芪总多糖的制备 黄芪药材粉碎后，加水回流提取2次，合并提取液，减压浓缩后，使相对密度为1g药材/ml，浓缩液通过AB-8大孔树脂柱，用水进行洗脱，洗脱液减压、真空干燥，即得黄芪总多糖。用紫外分光光度法，以葡萄糖为标准品进行测定，黄芪总多糖中多糖类成分含量为64％。
试验例3 五味子总木脂素和黄芪总多糖组合物的药效学试验 为了考察不同配比的总木脂素和黄芪总多糖的药效，找到最佳疗效的组方，设计不同试验，观察五味子总木脂素和黄芪总多糖对四氯化碳肝损伤小鼠肝功能的影响。实验选择的配比为1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6，五味子总木脂素剂量为0.02g/kg。另加阳性对照组联苯双酯滴丸、阴性对照组和模型组。
试验按有关文献报告的方法进行，连续给药7d。第7天，灌胃后1h，除空白对照组外，按组分别腹腔注射1％四氯化碳溶液10ml/kg。禁食16h后，摘眼球取血，以3000r/min离心15min，分离血清，测定血清中总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸转移酶(AST)。取血后，剖取肝脏，立即投入10％甲醛液内固定，石腊包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察。肝细胞坏死情况按以下标准进行分级计分。～(0分)未见坏死细胞；+(1分)偶见小叶中央散在肝细胞坏死灶；++(2分)少数小叶中央细胞灶状坏死或部分小叶细胞坏死，但层次较少；+++(3分)坏死细胞较广泛存在于肝小叶中央，呈灶状或片状；++++(4分)坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央，层次较多。实验结果采用SPSS11.0和DPS统计软件处理。
实验结果如下∶ (1)五味子总木脂素和黄芪总多糖对四氯化碳肝损伤小鼠肝功能的影响 模型组小鼠造模后16小时，血清T-BIL、GLB、ALT、AST明显升高，A/G明显降低，与空白组比较有显著性差异。连续预防给药7天后，各配伍比例组各项检测指标均有不同程度改善。其中，1∶0.5组T-BIL、D-BIL，1∶1组T-BIL、GLB、ALT、AST，1∶2组T-BIL、D-BIL、GLB、ALT、AST，1∶4组T-BIL，1∶6组T-BIL、D-BIL、GLB、ALT、AST明显降低；1∶4组和1∶6组A/G明显升高；与模型组比较，有显著或极显著性差异。1∶4组和1∶6组两组间比较无显著性差异。结果详见表7。
表7 各配伍比例组对四氯化碳肝损伤小鼠肝功能的影响(X±SD) 注与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
(2)五味子总木脂素和黄芪总多糖对四氯化碳小鼠肝组织损伤的影响 空白对照组除个别动物偶见淋巴样细胞浸润外，未见其他异常改变。模型组小鼠出现较广泛和弥漫性以小叶中心肝细胞坏死为主的组织学改变，坏死灶见肝细胞嗜伊红增强，无正常肝板结构，核消失或核缩，可见嗜伊红小体；并偶见肝细胞气球样变、空泡变、浊肿和小灶性出血及炎细胞浸润。各给药组肝细胞病变均明显减轻，与模型组比较有显著性或极显著性差异。结果详见表8。
表8 各配比剂量细对四氯化碳肝细胞坏死小鼠的影响 注与空白组比较，△△△P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
五味子木脂素和黄芪总多糖各配伍比例组均能明显改善四氯化碳所致小鼠肝损伤，明显对抗小鼠肝细胞坏死。其中以五味子总木脂素与黄芪总多糖以1∶2比例配伍改善肝功能和肝细胞损伤综合作用最好。


实施例2 五味子总木脂素15g 黄芪总多糖45g 取五味子750g，用10倍量50％的乙醇加热回流提取3次，第一次2小时，第二、三次每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩后，用750ml的25％乙醇稀释浓缩液，按照树脂量与药材量1∶1通过AB-8大孔树脂柱，即用750g大孔树脂填充柱。先以4倍体积的30％乙醇洗脱，再以8倍体积的95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，60℃减压浓缩，烘干至恒重，即得五味子总木脂素，其中含五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲和五味子醇甲为58.4％；取黄芪225 g，加10倍量的水回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩后，按照树脂量与药材量1∶1通过在D-101大孔树脂柱，即用225g大孔树脂填充柱。再以12倍体积的水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩即得黄芪多糖粗品，将黄芪多糖粗品反复用乙醇洗涤后，干燥，即得黄芪总多糖提取物，其黄芪总多糖的含量为62.4％；按上述配比将五味子总木脂素和黄芪总多糖混合、干燥，粉碎过100目筛，加入160g淀粉、10g淀粉硅胶中，混匀，直接装入胶囊，可制成1000粒，每粒含15mg五味子总木脂素和45mg黄芪总多糖的胶囊剂。口服，每日3次，每次2粒。
实施例3 五味子总木脂素85.7g 黄芪总多糖514.3g 取五味子4285g，用10倍量95％的乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩后，用4285ml的30％乙醇稀释浓缩液，按照树脂量与药材量1∶1通过ZTC-1大孔树脂柱，即用4285g大孔树脂填充柱，先以6倍体积的30％乙醇洗脱，再以10倍体积的95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，60℃减压浓缩，烘干至恒重，即得五味子总木脂素提取物，其中含五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲和五味子醇甲为54.6％；取黄芪2571.5g，加10倍量的水回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度1.25-1.4g/ml，加入95％的乙醇进行沉淀，放置后，收集沉淀，将沉淀经多次水洗醇沉后，再取沉淀物干燥，即得黄芪总多糖提取物，其黄芪总多糖的含量为60.8％；按上述配比将五味子总木脂素和黄芪总多糖混合、干燥、粉碎至200目，加入到已经溶胀好的200g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中，搅拌均匀，加入蒸馏水至100000ml，搅拌成混悬，即得每毫升含五味子总木脂素0.0857mg和黄芪总多糖5.143mg的混悬剂。口服，每日3次，每次20ml。
实施例4 五味子总木脂素50g 黄芪总多糖60g 取五味子2500g，用10倍量50％的乙醇加热回流提取3次，第一次2小时，第二、三次每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩后，用2500ml的25％乙醇稀释浓缩液，按照树脂量与药材量1∶1通过AB-8大孔树脂柱，即用2500g大孔树脂填充柱。先以4倍体积的30％乙醇洗脱，再以8倍体积的95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，60℃减压浓缩，烘干至恒重，即得五味子总木脂素，其中含五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲和五味子醇甲为52.5％；取黄芪300g，加10倍量的水回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩后，按照树脂量与药材量1∶1通过在D-101大孔树脂柱，即用300g大孔树脂填充柱。再以12倍体积的水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩即得黄芪多糖粗品，将黄芪多糖粗品反复用乙醇洗涤后，干燥，即得黄芪总多糖提取物，其黄芪总多糖的含量为54.6％；按上述配比将五味子总木脂素和黄芪总多糖混合、干燥，粉碎过100目筛，加入160g淀粉、10g淀粉硅胶中，混匀，直接装入胶囊，可制成1000粒，每粒含50mg五味子总木脂素和60mg黄芪总多糖的胶囊剂。口服，每日3次，每次2粒。
实施例5 五味子总木脂素25g 黄芪总多糖50g 取五味子1250g，用10倍量95％的乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩后，用1250ml的30％乙醇稀释浓缩液，按照树脂量与药材量1∶1通过ZTC-1大孔树脂柱，即用1250g大孔树脂填充柱，先以6倍体积的30％乙醇洗脱，再以10倍体积的95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，60℃减压浓缩，烘干至恒重，即得五味子总木脂素提取物，其中含五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲和五味子醇甲为60％；取黄芪250 g，加10倍量的水回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度1.25-1.4g/ml，加入95％的乙醇进行沉淀，放置后，收集沉淀，将沉淀经多次水洗醇沉后，再取沉淀物干燥，即得黄芪总多糖提取物，其黄芪总多糖的含量为65％；按上述配比将五味子总木脂素和黄芪总多糖混合、干燥，过100目筛，再将30g淀粉、40g乳糖粉碎过100目筛，混匀。将五味子总木脂素和黄芪总多糖组合物、5g羧甲基淀粉钠加入混匀的淀粉和乳糖中，混匀。加入100ml的7％淀粉浆拌匀，经16目铁筛丝网制粒，60℃以下干燥，整粒，加入1％硬脂酸镁1.55g混匀，分析含量后压片。可制成1000片每片含五味子总木脂素25mg和黄芪总多糖50mg的片剂。口服，每日3次，每次2片。


一种具有保肝作用的中药有效部位复方制剂，该制剂由从五味子中提取的总木脂素和从黄芪中提取的总多糖按一定配比组合而成。本发明的组合物既提高了传统中药的药理作用和临床疗效，同时降低了杂质含量，可制成各种制剂，用于肝损伤的治疗，实现了现代中药复方安全、有效、稳定、可控、方便的目的。