专利名称：一株米曲霉及其在提高酒精产量中的应用的制作方法酒精是一种重要的工业原料，广泛应用于化工、食品、军工和医药卫生等领域。同时酒精又是最有希望全部或部分替代石油的可再生能源，具有广泛的应用和发展前景。我国年产酒精200万吨以上，是世界第三大酒精生产国。随着国民经济的增长，酒精的需求量还会增加。每生产I吨酒精要排放出13-15吨蒸馏废液，全国每年的排放量约超过1500万吨，成为食品发酵行业中污染环境最严重的行业之一。蒸馏废液中含有大量未被利用的营养成分，如蛋白质、脂肪、纤维素、维生素B族、甘油、有机酸、发酵残余的碳水化合物等，因此蒸馏废液的回收再利用具有重大的应用前景。目前，国内外蒸馏废液的治理方法有灌溉法、氧化塘法、浓缩法、生产酵母蛋白一好氧法、厌氧法、厌氧一好氧法、物化法等，其中研究与应用较多的是厌氧生物处理和厌氧-好氧生物处理。德国克虏佰公司是最早研发出将薯类酒糟滤液全部回流用于酒精发酵工艺的公司，该工艺称为“LBW”，其技术关键是保证低温蒸煮，防止美拉德反应产生有害物质。固体颗粒蛋白饲料(DDGS)生产技术在欧洲国家，如德国、法国、挪威等也被广泛采用，该技术实质是将玉米酒糟液固液分离所得滤液一部分回用于酒精生产，另一部分蒸发浓缩后与固形物混合干燥制DDGS。提高蒸馏废液的回用率还需从多方面进行进一步的努力探索研究，选育适应回用抑制物高浓度的菌种是提高酒精废液回用率的好方法之一。
本发明的目的是提供一株米曲霉及其在提高酒精产量中的应用。本发明提供了一株米曲霉(Aspergillus oryzae),命名为HSC,已于2012年I月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 5725。米曲霉(Aspergillus oryzae)HSC CGMCC No. 5725 简称米曲霉 HSC。本发明还保护一种制备米曲霉HSC的发酵液的方法，包括如下步骤(I)将米曲霉HSC接种至发酵培养基，20-37°C (如20_30°C或30_37°C )振荡培养30-60小时(30-48小时或48-60小时)；(2)将完成步骤(I)的培养体系过滤收集滤液,即为米曲霉HSC发酵液。所述发酵培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂可为酒精废液，也可由酒精废液与水组成；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度如下5-100g/L(如5-50g/L或50_100g/L)葡萄糖、O. l-10g/L (如 O. l-5g/L 或 5-10g/L) KH2PO4 和 O. Ι-lOg/L (如 O. l_5g/L 或 5-10g/DMgSO4 · 7H20。所述溶剂中，所述酒精废液所占的体积比为10%以上(如10% -50%或、50% -100% )。所述米曲霉HSC具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比为(1-20) (99-80)，如(1-10) (99-90)或(10-20) (90-80)。每IOOml所述种子液中具体可含O. 2g干重的菌体。所述振荡培养的转速可为100-200rpm，如100_160rpm或160_200rpm。以上任一所述方法制备得到的米曲霉HSC发酵液均属于本发明的保护范围。本发明还保护一种制备固体颗粒蛋白饲料的方法，包括如下步骤(I)将米曲霉HSC接种至发酵培养基，20_37°C (如20_3(TC或30_37°C )振荡培养 30-60小时(30-48小时或48-60小时)；(2)将完成步骤(I)的培养体系过滤收集菌体,即为固体颗粒蛋白饲料。所述发酵培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂可为酒精废液，也可由酒精废液与水组成；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度如下5-100g/L(如5-50g/L或50_100g/L)葡萄糖、O. l-10g/L (如 O. l-5g/L 或 5-10g/L) KH2PO4 和 O. Ι-lOg/L (如 O. l_5g/L 或 5-10g/DMgSO4 · 7H20。所述溶剂中，所述酒精废液所占的体积比为10%以上(如10% -50%或50% -100% )。所述米曲霉HSC具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比为(1-20) (99-80)，如(1-10) (99-90)或(10-20) (90-80)。每IOOml所述种子液中具体可含O. 2g干重的菌体。所述振荡培养的转速可为100-200rpm，如100_160rpm或160_200rpm。以上任一所述方法制备得到的固体颗粒蛋白饲料均属于本发明的保护范围。米曲霉HSC可用于生产酒精，也可用于促进酿酒酵母生产酒精。所述米曲霉HSC发酵液可用于生产酒精，也可用于促进酿酒酵母生产酒精。所述酿酒酵母具体可为中国工业微生物菌种保藏中心编号为31145的菌株。本发明还保护一种生产酒精的方法，包括如下步骤(I)将I千克玉米淀粉与3-6千克(如3-4. 5千克或4. 5-6千克)50_6(TC (如50-55 V或55-60 V )的液体丁混合，糊化后加入淀粉酶，80-100 V (如80-90 V或90-1000C )孵育1-1. 5小时(如1-1. 2小时或I. 2-1. 5小时)；然后冷却至60-65°C (如60-63°C或 63-65°C )并加入糖化酶，60_70°C (如 60-65°C或 65_70°C )孵育 10-15 小时(如10-12小时或12-15小时)；过滤并收集滤液，即为糖化液；所述液体丁是将9-4体积份(如9-7体积份或7-4体积份)酒精废液和1-6体积份(如1-3体积份或3_6体积份)所述米曲霉HSC发酵液混合得到的；所述淀粉酶的加入量为每克玉米淀粉加入4-30U淀粉酶(如4-18U或18-30U);所述糖化酶的加入量为每克玉米淀粉加入50-200U糖化酶(如50-125U 或 125-250U)；(2)在步骤⑴的糖化液中接种酿酒酵母，得到初始发酵体系，发酵后得到酒精。所述发酵条件具体可为20_40°C (如20_30°C或30_40°C )静置培养30-60小时(如30-45小时或45-60小时)。所述初始发酵体系中，所述酿酒酵母的浓度可为lX 105-3X 106cfu/ml (如I X IO5-L 5 X 106cfu/ml 或 I. 5 X 106_3 X 106cfu/ml)。所述酿酒酵母具体可以以种子液的方式接种至所述糖化液。所述种子液与所述糖化液的体积配比为(1-30) (99-70)，如(1-15) (99-85)或(15-30) (85-70)。所述酿酒酵母具体可为中国工业微生物菌种保藏中心编号为31145的菌株。以上任一所述酒精废液可为实验室制备的酒精废液，也可为酒厂生产酒精废弃的酒精废液。实验室制备酒精废液的具体方法可如下(I)将I千克玉米淀粉与3-6千克50_60°C水混合，糊化后加入淀粉酶，80_100°C孵育1-1. 5小时；然后冷却至60-65°C并加入糖化酶，60-70°C孵育10-15小时；过滤并收集 滤液，即为糖化液；所述淀粉酶的加入量为每克玉米淀粉加入4-30U淀粉酶；所述糖化酶的加入量为每克玉米淀粉加入50-200U糖化酶；(2)将酿酒酵母接种于步骤⑴的糖化液，得到初始发酵体系，20-40°C静置培养30-60小时。(3)将完成步骤(2)的培养体系蒸馏，剩余液体即为酒精废液。所述初始发酵体系中，所述酿酒酵母的浓度为I X 105-3 X IO6CfVml (如I X IO5-L 5 X 106cfu/ml 或 I. 5 X 106_3 X 106cfu/ml)。所述酿酒酵母具体可以以种子液的方式接种至所述糖化液。所述种子液与所述糖化液的体积配比为(1-30) (99-70)。所述酿酒酵母具体可为中国工业微生物菌种保藏中心编号为31145的菌株。所述蒸馏具体可为50°C蒸馏20min。所述方法可以引入酒精制备工艺，即在添加所述发酵液的基础上将酒精废液作为原料循环。采用本发明的方法培养米曲霉HSC，一方面可以生产菌体蛋白饲料，一方面可以得到发酵液。所述发酵液可用于生产酒精，利用酒精废液的同时大大提高酿酒酵母的酒精产量。本发明具有重大的经济效益和社会效益。图I为峰面积与酒精浓度的标准曲线。
实施例中所用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)均为如下酵母购自中国工业微生物菌种保藏中心(http://www. china-cicc. org/),编号为31145。实施例I、米曲霉的获得和鉴定一、米曲霉的获得从酒厂附近取土样。I、称取5. Og土壤于45ml无菌富集培养基中,加入适量玻璃珠振摇数分钟后,放入30°C恒温培养箱中富集培养24h。
富集培养基蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、蔗糖20g/L、可溶性淀粉10g/L、K2HP042g/UZnSO4 O. 4g/L,CuSO4 O. 05g/L,MgSO4 O. 01g/L，其余为水，灭菌后冷却至50°C时加入青霉素使其浓度为lU/ml。2、将培养液用无菌O. 9%生理盐水进行梯度稀释，取10_4、10_5、10_6三个梯度，采用稀释倒平板法在分离纯化培养基上进行分离。于30°C恒温培养箱中培养24h。分离纯化培养基将2g琼脂加入酒精废液并用酒精废液定容至100mL。3、用无菌接种环挑取各单菌落分别于无菌0.9%生理盐水中稀释，之后分别接种于分离纯化培养基上进行单菌落培养，反复多次后直至平皿中菌落形态一致。4、用无菌接种环挑取各单菌落分别于无菌0.9%生理盐水中稀释，之后以10%(体积比)接种到复筛培养基，于30°C、pH5. 5、160rpm条件下振摇培养48h。复筛培养基50 % (体积比)酒精废液、5g/L葡萄糖、2g/L KH2PO4,2g/LMgSO4 · 7H20，其余为水。5、将发酵液中菌体过滤，烘干后称重，确定在酒精废液中能够良好生长的霉菌。6、根据菌落形态特征和显微镜观察进行初步分类。获得一株菌株，命名为HSC。二、米曲霉的鉴定I、形态特征菌株在分离纯化培养基上生长较快，菌落初成白色，后变成黄色或黄绿色，背部无色。在显微镜下可以观察到，菌丝发达，有隔膜，菌丝顶端直接产生孢子梗，分生孢子串生。参照《真菌鉴定手册》，将该菌株初步确定为曲霉属。2、分子鉴定进行26SrDNS ITS区序列分析，测序结果见序列表的序列I。将测序结果与NCBI数据库Blast比对，确定该菌与米曲霉序列(HQ285587. I)相似性很高，其同源性达到99%，可以确定该菌属于米曲霉(Aspergillus oryzae)。本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)HSC,已于2012年I月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5725。米曲霉(Aspergillus oryzae)HSC CGMCC No. 5725 简称米曲霉 HSC。实施例2、米曲霉HSC在酒精废液再利用中的应用一、酒精废液的制备I、将I千克玉米淀粉与3千克50°C的水混合，糊化后加入淀粉酶(每克玉米淀粉加入4U淀粉酶)，80°C孵育Ih ;然后冷却至60°C并加糖化酶(每克玉米淀粉加入50U糖化酶)，60°C孵育IOh ;四层纱布过滤并收集滤液，即为糖化液。2、将酿酒酵母接种至在YPD培养基中，30°C、160rpm振荡培养(摆振幅度25mm) 24h，得到种子液。3、将I体积份种子液接种至99体积份糖化液中，得到初始发酵体系(初始发酵体系中酿酒酵母的浓度为lX105cfu/ml);将初始发酵体系20°C静置培养30h，得到终止发酵体系。 4、将终止发酵体系50°C蒸馏20min，剩余液体即为酒精废液。二、米曲霉发酵上清的制备I、将米曲霉HSC在PDA培养基中培养，得到种子液(每IOOml种子液含O. 2g干重的菌体)。2、将步骤I得到的种子液接种至发酵培养基(种子液与发酵培养基的体积配比为I 99)中，20°C、IOOrpm振荡培养(摆振幅度25mm) 30h。发酵培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂是将9体积份水和I体积份酒精废液混合得到的；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度如下5g/L葡萄糖、O. lg/L KH2P04、0. lg/LMgSO4 · 7H20。3、将步骤2的培养体系用四层纱布过滤，分别收集滤液(米曲霉发酵液)和菌体。4、将步骤3获得的菌体烘干至恒重，即为菌体蛋白饲料，每100毫升培养体系获得了 1.78g菌体蛋白饲料。三、米曲霉在酒精废液再利用方面的应用I、米曲霉在酒精废液再利用方面的应用(I)将I千克玉米淀粉与3千克50°C的液体甲(由9体积份酒精废液与I体积份米曲霉发酵液组成)混合，糊化后加入淀粉酶(每克玉米淀粉加入4U淀粉酶)，80°C孵育Ih ;然后冷却至60°C，加糖化酶(每克玉米淀粉加入50U糖化酶)，60°C孵育IOh ;四层纱布过滤并收集滤液，即为糖化液。(2)将酿酒酵母接种至在YPD培养基中，在YPD培养基中培养，得到种子液。(3)将I体积份种子液接种至99体积份糖化液中，得到初始发酵体系(初始发酵体系中酿酒酵母的浓度为lX105cfu/ml);将初始发酵体系20°C静置培养30h，得到终止发酵体系。(4)将完成步骤(3)的培养体系4000rpm离心(离心半径为13. 5cm) IOmin,收集上清液并用细菌过滤器(O. 22 μ m)过滤，得到无细胞滤液。2、对照试验甲(I)将I千克玉米淀粉与3千克50°C的酒精废液混合，糊化后加入淀粉酶(每克玉米淀粉加入4U淀粉酶)，80°C孵育Ih ;然后冷却至60°C，加糖化酶(每克玉米淀粉加入50U糖化酶)，60°C孵育IOh ;四层纱布过滤并收集滤液，即为糖化液。步骤(I)至⑷同步骤I的⑵至⑷。3、对照试验乙(I)将I千克玉米淀粉与3千克50°C的水混合，糊化后加入淀粉酶(每克玉米淀粉加入4U淀粉酶)，80°C孵育Ih ;然后冷却至60°C，加糖化酶(每克玉米淀粉加入50U糖化酶)，60°C孵育IOh ;四层纱布过滤并收集滤液，即为糖化液。
步骤(I)至(4)同步骤I的⑵至⑷。3、无细胞滤液中的酒精含量测定采用HPLC检测无细胞滤液中的酒精含量。HPLC参数仪器Agilent 1200 ；色谱柱ReZeX ROA及相应的保护柱；检测器为示差检测器；进样量20 yL ;流动相为
0.005MH2S04水溶液；流速0. 6ml/min ;柱温65°C。采用酒精标准品制作标准曲线，酒精的保留时间为22. 02min，峰面积与酒精浓度的标准曲线见图I (标准曲线方程为Y =141027. 5Χ-11941. 4 ；R2 = O. 9991)。通过标准曲线计算无细胞滤液中的酒精含量。步骤I得到的无细胞滤液中的酒精含量为30. 04mg/ml，与步骤2得到的无细胞滤液中的酒精含量相比提高了 6. 25%，与步骤3得到的无细胞滤液中的酒精含量相比提高了
4.57%。实施例3、米曲霉在酒精废液再利用中的应用一、酒精废液的制备I、将I千克玉米淀粉与6千克60°C的水混合，糊化后加入淀粉酶(每克玉米淀粉加入30U淀粉酶)，10(TC孵育I. 5h ;然后冷却至65°C，加糖化酶(每克玉米淀粉加入200U糖化酶)，70°C孵育15h，四层纱布过滤并收集滤液，即为糖化液。2、将酿酒酵母接种至在YPD培养基中，30°C、160rpm振荡培养(摆振幅度25mm) 24h，得到种子液。3、将30体积份种子液接种至70体积份糖化液中，得到初始发酵体系(初始发酵体系中酿酒酵母的浓度为3X 106cfu/ml);将初始发酵体系40°C静置培养60h，得到终止发酵体系。4、将终止发酵体系50°C蒸馏20min，剩余液体即为酒精废液。二、米曲霉发酵上清的制备I、将米曲霉HSC在PDA培养基中培养，得到种子液(每IOOml种子液含O. 2g干重的菌体)。2、将步骤I得到的种子液接种至发酵培养基(种子液与发酵培养基的体积配比为20 80)中，37°C、200rpm 振荡培养(摆振幅度 25mm)60h。发酵培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂是酒精废液；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度如下100g/L 葡萄糖、10g/L KH2P04、10g/L MgSO4 · 7H20。3、将步骤2的培养体系用四层纱布过滤，分别收集滤液(米曲霉发酵液)和菌体。4、将步骤3获得的菌体烘干至恒重，即为菌体蛋白饲料，每100毫升培养体系获得了 2. 3g菌体蛋白饲料。三、米曲霉在酒精废液再利用方面的应用I、米曲霉在酒精废液再利用方面的应用(I)将I千克玉米淀粉与6千克60°C的液体乙(由4体积份酒精废液与6体积份米曲霉发酵液组成)混合，糊化后加入淀粉酶(每克玉米淀粉加入30U淀粉酶)，100°C孵育
1.5h ;然后冷却至65°C，加糖化酶(每克玉米淀粉加入200U糖化酶)，70°C孵育15h ;四层纱布过滤并收集滤液，即为糖化液。(2)将酿酒酵母接种至在YPD培养基中，在YPD培养基中培养，得到种子液。(3)将30体积份种子液接种至70体积份糖化液中，得到初始发酵体系(初始发酵体系中酿酒酵母的浓度为3X 106cfu/ml);将初始发酵体系40°C静置培养60h，得到终止发酵体系。(4)将完成步骤(3)的培养体系4000rpm离心(离心半径为13. 5cm) IOmin,收集上清液并用细菌过滤器(O. 22 μ m)过滤，得到无细胞滤液。2、对照试验甲(I)将I千克玉米淀粉与6千克60°C的酒精废液混合，糊化后加入淀粉酶(每克玉米淀粉加入30U淀粉酶)，10(TC孵育I. 5h ;然后冷却至65°C，加糖化酶(每克玉米淀粉加入200U糖化酶)，70°C孵育15h ;四层纱布过滤并收集滤液，即为糖化液。步骤(I)至⑷同步骤I的⑵至⑷。3、对照试验乙 (I)将I千克玉米淀粉与6千克60°C的水混合，糊化后加入淀粉酶(每克玉米淀粉加入30U淀粉酶)，10(TC孵育I. 5h ;然后冷却至65°C，加糖化酶(每克玉米淀粉加入200U糖化酶)，70°C孵育15h ;四层纱布过滤并收集滤液，即为糖化液。步骤(I)至⑷同步骤I的⑵至⑷。3、无细胞滤液中的酒精含量测定同实施例2的步骤三的3。步骤I得到的无细胞滤液中的酒精含量为21. 76mg/ml，与步骤2得到的无细胞滤液中的酒精含量相比提高了 11.2%，与步骤3得到的无细胞滤液中的酒精含量相比提高了10. 1%。实施例4、米曲霉在酒精废液再利用方面的应用本实施例中的酒精废液获自吉林燃料乙醇有限责任公司，具体组分见表I。表I吉林燃料乙醇有限责任公司酒精废液的质检中心检测报告
8:00~13:00
~多糖(g/L)34. 2035. 65
麦芽三糖(g/L)2. 582.61
麦芽糖(g/L)16. 7916. 35
葡萄糖(g/L)11. 5811.90
果糖(g/L)5Λ35785
阿拉伯糖(g/L)9 6910.03
丁二酸(g/L)Γ25 Γ62
乳酸(g/L)33.4433. 3

本发明公开了一株米曲霉及其在提高酒精产量中的应用。本发明提供的米曲霉，保藏号为CGMCC No.5725。本发明还保护一种生产酒精的方法(1)将1千克玉米淀粉与3-6千克50-60℃的液体丁混合，糊化后加入淀粉酶，80-100℃孵育1-1.5小时；然后冷却至60-65℃并加入糖化酶，60-70℃孵育10-15小时；过滤并收集滤液，即为糖化液；液体丁是将9-4体积份酒精废液和1-6体积份米曲霉发酵液混合得到的；(2)在糖化液中接种酿酒酵母，发酵后得到酒精。采用本发明的方法培养米曲霉，一方面可生产菌体蛋白饲料，一方面可得到发酵液。所述发酵液可用于生产酒精，利用酒精废液的同时大大提高酿酒酵母的酒精产量。本发明具有重大的经济效益和社会效益。