技术领域
中的进展已导致产生出抗体片段例如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段及其他抗体片段这些更小的分子保留了完整抗体的抗原结合活性，并且还可以展示出相比于完整免疫球蛋白分子而言经改善的组织渗透和药物代谢动力学特性事实上，抗体片段被证明是多用途的治疗剂，如通过产品例如ReoPro?和Lucent is?的近期成功而可见的尽管此类片段看起来展示出超过完整免疫球蛋白的许多优点，但它们还遭受了增加的从血清中的清除率，因为它们缺乏赋予长的体内寿命的Fe 结构域(Medasan 等人，1997，J.1mmunol.1582211-2217)[0004]先前已描述了具有双特异性即与两种不同的抗原相结合的抗体(关于综述，参见 Segal 等人,1999, Curr.0pin.1mmunol.11558-562 ；Pliickthun&Pack, 1997, Immunotechnology, 383-105 ；Fischer 和 Leger, 2007，Pathobiology, 74，3-14)在 W002/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203 和 US2006280734 中也描述了双特异性抗体用于制备基于 异双特异性抗体的分子的先前方法一般采用化学交联或者蛋白质改造技术化学交联遭受了异和同二聚体形成的产率差以及要求进行其后续的色谱法分离蛋白质改造方法已高度地进行了详细阐述(例如，件-白(knobs-1nto-holes)改造；Ridgway等人，1996，Protein Eng.9(7)617-621)或已使用了具有不合适的稳定性特征的分子(例如，双抗体，scFv)0在某些情况下，双特异性抗体还可以遭受位阻问题，从而使得两种抗原无法同时与每条抗体臂相结合[0005]单可变结构域抗体也称为单结构域抗体或dAbs，其相应于抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)Ward等人，1989，Nature, 341，544-546描述了鼠类单结构域抗体人单结构域抗体和‘骆骑化的(camelised)’人单结构域抗体也已得到描述(Holt等人，2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490)还已从骆骑科动物(骆骑和美洲骑)和软骨鱼(须鲨和铰口鲨)中获得了单结构域抗体这些生物已进化出了安装在Fe-等价恒定结构域构架上的高亲和力单V-样结构域(在骆驼科动物中称为VhH，和在鲨鱼中称为V-NAR),以作为其免疫系统的完整且至关重要的组分(关于综述，参见Holliger&Hudson ；2005, Nature Biotechnology, 23 (9) 1126-1136)[0006]在EP0368684中描述了单结构域抗体-酶融合物在W02004/058820中还描述了单结构域-效应子基团融合物，其包含单个可变结构域在W02007/024715中描述了双重可变结构域免疫球蛋白在EP1517921中描述了包含两个具有不同特异性的单结构域抗体的双特异性配体[0007]用于改善抗体片段例如？1?&13、？&13’、？(&13’)2和其他抗体片段的半衰期的手段是已知的一种方法使所述片段与聚合物分子相缀合因此，已通过缀合至聚乙二醇(PEG)而改善了 Fab’、F(ab’)2片段在动物中的短的循环半衰期(参见例如，W098/25791、W099/64460和TO98/37200)另一种方法通过缀合至与FcRn受体相互作用的试剂来修饰所述抗体片段(参见例如，W097/34631)延长半衰期的另外一种方法使用结合血清白蛋白的多肽(参见例如，Smith 等人，2001，Bioconjugate Chem.12750-756 ；EP0486525 ；US6267964 ；W004/001064 ；W002/076489 ;和W001/45746)然而，仍然需要产生具有长的体内半衰期的抗原结合性免疫球蛋白蛋白质，以作为因为与FcRn受体相互作用而具有长的半衰期的那些的备选方案，其中没有通过缀合至PEG来进行化学修饰或者缀合至人血清白蛋白[0008]各种蛋白质存在于血浆中，并且包括甲状腺素结合蛋白、运甲状腺素蛋白、α 1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白，或者它们中的任何的片段血清载体蛋白在机体内循环，具有以天测量的半衰期，例如对于甲状腺素结合蛋白来说为5天或者对于运甲状腺素蛋白来说为 2 天(Bartalena&Robbins, 1993，Clinics in Lab.Med.13583-598)，或者在碘化的α 1-酸性糖蛋白的周转的第二个阶段中为65小时(Bree等人，1986，Cl in.Pharmacokin.11336-342)来自 Gitlin 等人(1964，J.Clin.1nvest.101938-1951)的数据暗示，在孕妇中，α 1-酸性糖蛋白的半衰期为3.8天，对于转铁蛋白为12天，和对于纤维蛋白原为2.5天血清白蛋白是在血管和血管外区室中都丰富的蛋白质，其在人中的半衰期为大约 19 天(Peters, 1985，Adv Protein Chem.37161-245)这与为大约 21 天的 IgGl的半衰期相似(Waldeman&Strober, 1969, Progr.Allergy, 131-110)[0009]本发明提供了经改善的双特异性抗体融合蛋白，其可以重组地产生并且能够同时结合两种抗原[0010]因此，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一步包含具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体(dAb)ο[0011]本发明还提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一步包含至少一个具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体[0012]本发明的双特异性抗体融合物将能够与两种目的抗原选择性地相结合[0013]在一个实施方案中，由所述Fab或Fab’片段所结合的目的抗原可以是细胞关联蛋白，例如在细胞例如细菌细胞、酵母细胞、T-细胞、内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白目的抗原还可以是任何在医学上相关的蛋白质，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白质，例如受体和/或其相应的配体细胞表面蛋白的具体例子包括粘附分子，例如整联蛋白例如β I整联蛋白例如VLA-4，E-选择蛋白，P选择蛋白或L-选择蛋白，CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33,CD38，CD40，CD45，CDW52, CD69，CD134 (0X40)，I COS, BCMP7, CD137，CD27L，CDCP1，DPCRl,DPCRl, CluCluIin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455,LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，柄蛋白-样 2，NKCCl，PTK7, RAIGl，TCAMl，SC6, BCMP101, BCMP84,BCMPlI, DTD，癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFG1和2)，I类MHC和II类MHC抗原，和VEGF,以及适当时，它们的受体[0014]可溶性抗原包括白介素例如IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17,病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原,免疫球蛋白例如IgE,干扰素例如干扰素α、干扰素β或干扰素Y，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生长因子例如TOGF-α和TOGF-β，以及适当时，它们的受体其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒例如流感、EBV, HepA, B和C，生物恐怖主义试剂，放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素[0015]在一个实施方案中，本发明的抗体融合蛋白可以用于在功能上改变目的抗原的活性例如，所述抗体融合蛋白可以直接地或间接地中和、拮抗或激动所述抗原的活性[0016]在一个实施方案中，由本发明的双特异性抗体融合蛋白中的所述单结构域抗体所结合的第二目的抗原可以是细胞关联蛋白，例如在细胞例如细菌细胞、酵母细胞、T-细胞、内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白目的抗原还可以是任何在医学上相关的蛋白质，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白质，例如受体和/或其相应的配体细胞表面蛋白的具体例子包括粘附分子，例如整联蛋白例如β I整联蛋白例如VLA-4，E-选择蛋白，P选择蛋白或L-选择蛋白，⑶2，⑶3，⑶4，⑶5，⑶7，⑶8，⑶11a，CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD 134 (0X40)，I COS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP I, DPCRl, DPCRl, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2,KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，柄蛋白-样 2，NKCCl，PTK7, RAIG1, TCAMl, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMPlI, DTD，癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFGI和2)，I类MHC和II类MHC抗原，和VEGF，以及适当时，它们的受体[0017]可溶性抗原包括白 介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17,病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原,免疫球蛋白例如IgE,干扰素例如干扰素α、干扰素β或干扰素Y，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生长因子例如TOGF-α和TOGF-β，以及适当时，它们的受体其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒例如流感、EBV, HepA, B和C，生物恐怖主义试剂，放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素[0018]可以由所述单结构域抗体所结合的其他抗原包括血清载体蛋白、使得能够进行细胞介导的效应子功能募集的多肽以及核素螯合剂蛋白质[0019]因此，在一个实例中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一步包含具有对于第二种蛋白质的特异性的单结构域抗体，后者提供了募集效应子功能(例如补体途径激活和/或效应细胞募集)的能力此外，由于与核素螯合剂蛋白质相结合的单结构域抗体，本发明的融合蛋白可以用于螯合放射性核素此类融合蛋白可在成像或放射性核素靶向方法(以进行治疗)中使用[0020]因此，在一个实例中，提供了分离的双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于募集多肽的特异性的dAb相融合，所述dAb通过与所述募集多肽相结合而提供了直接地或间接地募集细胞介导的效应子功能的能力[0021]效应子功能的募集可以是直接的，因为效应子功能与细胞相关联，所述细胞在其表面上携带有募集分子当dAb与募集分子的结合引起例如下述因子的释放时，可以发生间接募集所述因子可以直接地或间接地募集效应子功能，或者可以经由信号传导途径的激活例子包括TNFa、IL2、IL6、IL8、IL17、IFN Y、组胺、Clq、调理素以及经典和旁路补体激活级联的其他成员，例如C2、C4、C3-转变酶和C5至C9[0022]如本文所使用的，“募集多肽”包括Fe Y R例如Fe Y R1、Fc Y RII和Fe Y RIII，补体途径蛋白例如但不限于Clq和C3,⑶标志蛋白(分化群(Cluster of Differentiation)标志物)例如但不限于 CD68、CD115、CD16、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、CD28、⑶45、⑶19、⑶20和⑶22为⑶标志蛋白的进一步的募集多肽包括⑶1、⑶IcU⑶2、⑶5、CD8、CD9、CD10、CDll、CDlla、CDllb、CDllc、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD40、CD43、CD44、CD45、CD46、CD49、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62、D62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD66e、CD68、CD70、CD71、CD72、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD88、CD89、CD90、CD94、CD95、CD98、CD106、CD 114、CD116、CD117、CD118、CD120、CD122、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD137、CD138、CD141、CD142、CD143、CD146、CD147、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD162、CD164、CD169、CD184、CD206、CD209、CD257、CD278、CD281、CD282、CD283和CD304，或它们中的任何的片段，所述片段保留了直接地或间接地募集细胞介导的效应子功能的能力募集多肽还包括具有效应子功能的免疫球蛋白分子，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE 和 IgA0[0023]在一个实施方案中，dAb对于其具有特异性的第二种蛋白质是补体途径蛋白，其中Clq是特别优选的[0024]在优选的实施方案中，dAb对于其具有特异性的第二种蛋白质是CD标志蛋白，其中 CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35 是特别优选的[0025]因此，还提供了分离的双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体片段，所述片段与至少一个dAb相融合，所述dAb具有对于选自下列的CD分子的特异性CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35[0026]在一个实施方案中，所述单结构域抗体为具有第一特异性的免疫球蛋白部分提供了延长的半衰期[0027]因此，在一个实施方案中，提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特异性的单结构域抗体相融合，所述单结构域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1相结合而为具有对于所述目的抗原的特异性的所述抗体片段提供了延长的半衰期[0028]在一个实施方案中，提供了分离的双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特异性的单结构域抗体相融合，所述单结构域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1相结合而为具有对于所述目的抗原的特异性的所述抗体片段提供了延长的半衰期[0029]如本文所使用的，“血清载体蛋白”包括甲状腺素结合蛋白、运甲状腺素蛋白、α 1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白，或它们中的任何的片段[0030]如本文所使用的，“循环免疫球蛋白分子”包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM和IgD、或它们中的任何的片段[0031]⑶35/CR1是存在于红细胞上的蛋白质，其具有36天的半衰期(正常范围为28至47 天；Lanaro 等人,1971, Cancer, 28 (3) 658-661 )[0032]在优选的实施方案中，dAb对于其具有特异性的第二种蛋白质是血清载体蛋白，其中人血清载体蛋白是特别优选的在最优选的实施方案中，所述血清载体蛋白是人血清白蛋白[0033]因此，提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于人血清白蛋白的特异性的单结构域抗体相融合[0034]在一个实施方案中，本发明提供了分离的双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于人血清白蛋白的特异性的单结构域抗体相融合[0035]在一个实施方案中，具有对于目的抗原的特异性的所述抗体片段是Fab片段在另一个实施方案中，具有对于目的抗原的特异性的所述抗体片段是Fab’片段[0036]因此，在一个最优选的实施方案中，本发明的抗体融合蛋白是翻译融合蛋白，即基因融合物，其各自的序列由表达载体编码备选地，所述抗体融合蛋白组分通过使用化学手段，即通过化学缀合或化学交联进行融合此类化学手段是本领域已知的[0037]在一个实例中，所述抗体片段是Fab’片段，其具有天然的或经修饰的铰链区当用于在制备本发明的双特异性抗体融合蛋白中使用的抗体片段是Fab’片段时，所述片段一般在重链的C-末端处延长一个或多个氨基酸因此，本发明的抗体融合物可以包含直接地或经由接头与dAb相翻译融合(或化学融合)的Fab’片段此外，合适的抗体Fab’片段的例子包括在W02005003170和W02005003171中描述的那些[0038]在另一个实例中，所述抗体片段是Fab片段因此，本发明的抗体融合物可以包含与接头序列相翻译融合(或化学融合)的Fab片段，而所述接头序列与dAb相翻译融合(或化学融合)优选地，所述Fab片段是在链间半胱氨酸处终止的Fab片段，如W02005/003169中所描述的[0039]在本发明中有用的抗体Fab或Fab’片段可以来自任何物种，但优选地源自单克隆抗体、人抗体，或者是人源化的片段用于在本发明中使用的抗体片段可以源自免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类，并且可以获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人[0040]在一个实施方案中，所述抗体Fab或Fab’片段是单克隆的、完全人的、人源化的或嵌合的抗体片段在一个实施方案中，所述抗体Fab或Fab’片段是完全人的或人源化的[0041]单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法来制备,例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein, Nature, 1975，256，495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunology Today, 1983, 4, 72)和 EBV-杂交瘤技术(Cole 等人,“MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，，,第 77-96 页,Alan R.Liss, Inc., 1985)[0042] 用于在本发明中使用的抗体还可以使用单淋巴细胞抗体方法来产生，所述单淋巴细胞抗体方法通过克隆且表达从被选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞中产生的免疫球蛋白可变区cDNAs,其中通过例如由Babcook, J.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1996, 93(15), 7843-7848 ；W092/02551 ；W02004/051268 ;和 W02004/106377 所描述的方法来进行[0043]人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补性决定区(⑶Rs)和来自人免疫球蛋白分子的构架区(参见例如US5，585，089)[0044]用于在本发明中使用的抗体还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生，并且包括由下列文献所公开的那些Brinkman等人，J.1mmunol.Methods, 1995, 182, 41-50 ；Ames 等人，J.1mmunol.Methods,1995, 184, 177-186 ；Kettleborough 等人，Eur.J.1mmunol.,1994，24，952-958 ;Persic 等人,Gene, 1997187, 9-18 ；和 Burton 等人,Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280 ；W090/02809 ；W091/10737 ；W092/01047 ；W092/18619 ；W093/11236 ；W095/15982 ；和W095/20401 ；和 US5, 698，426 ；5, 223，409 ；5, 403，484 ；5, 580，717 ；5, 427，908 ；5, 750，753 ；5，821，047 ；5, 571，698 ；5, 427，908 ；5, 516，637 ；5, 780，225 ；5, 658，727 ；5, 733，743 ；和5，969，108此外，转基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳动物)可以用于产生人源化抗体[0045]完全人的抗体是这样的那些抗体，在所述抗体中重链和轻链的可变区和恒定区(当存在时)都是人起源的，或者基本上等同于人起源的序列，不必来自相同的抗体完全人的抗体的例子可以包括例 如通过上文所描述的噬菌体展示方法而产生的抗体，和由其中鼠类免疫球蛋白可变区和恒定区基因已被其人对应物替代的小鼠所产生的抗体，例如如在 EP0546073B1、US5, 545，806、US5, 569，825、US5, 625，126、US5, 633，425、US5, 661，016、US5, 770, 429、EP0438474B1 和 EP0463151B1 中所概括性地描述的[0046]用于在本发明中使用的抗体Fab或Fab ’片段起始材料可以获自任何完整的抗体，尤其是完整的单克隆抗体，其中使用任何合适的酶促切割和/或消化技术，例如通过用胃蛋白酶进行处理备选地或者另外地，抗体起始材料可以通过使用重组DNA技术来制备，其中牵涉编码抗体可变区和/或恒定区的DNA的操作和再表达标准分子生物学技术可以用于修饰、添加或删除氨基酸或结构域，如所希望的对于可变区或恒定区的任何改变仍然包括在本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”的范围内[0047]所述抗体片段起始材料可以获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人所述抗体片段的部分可以获自超过一个物种，例如所述抗体片段可以是嵌合的在一个实例中，恒定区来自一个物种，而可变区来自另一个物种所述抗体片段起始材料也可以是经修饰的在另一个实例中，所述抗体片段的可变区通过使用重组DNA改造技术来形成此类经改造的变化形式包括例如通过对于天然抗体的氨基酸序列进行插入、缺失或改变而从天然抗体可变区形成的那些这种类型的具体例子包括这样的那些经改造的可变区结构域，其包含来自一种抗体的至少一个⑶R和任选地一个或多个构架氨基酸，以及来自第二种抗体的该可变区结构域的其余部分用于形成和制备这些抗体片段的方法是本领域众所周知的(参见例如，Boss等人，US4, 816，397 ；Cabilly等人，US6, 331，415 ；Shrader 等人，W092/02551 ；ffard 等人，1989，Nature, 341，544 ；Orlandi 等人,1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86, 3833 ；Riechmann 等人,1988, Nature, 322, 323 ；Bird 等人，1988，Science, 242，423 ；Queen 等人，US5, 585，089 ；Adair, W091/09967 ；Mountain 和 Adair, 1992,Biotechnol.Genet.Eng.Rev, 10, 1-142 ；Verma 等人,1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)[0048]在本发明中，与Fab或Fab’片段相融合的每个单结构域抗体可以直接地或经由接头进行连接[0049]用于使dAb与Fab或Fab’相连接的合适的接头区的例子包括但不限于，柔性接头序列和刚性接头序列柔性接头序列包括在下列文献中所描述的那些Huston 等人，1988，PNAS855879-5883 ;Wright&Deonarain，Mol.1mmunol.，2007，44(11)2860-2869 ;Alfthan 等人,Prot.Eng., 1995, 8 (7) 725-731 ；Luo 等人，J.Biochem.，1995，118 (4)825-831 ；Tang 等人，1996，J.Biol.Chem.271 (26) 15682-15686 ;和 Turner 等人，1997，JIMM205，42-54 (关于代表性的例子参见表1)[0050]表1.柔性接头序列[0051]
