专利名称：用于治疗幽门螺杆菌感染的化合物、药物和方法作为病原体的幽η螺杆菌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是革兰氏阴性细菌,其定殖在世界上超半数人群的胃部和十二指肠粘膜上。发现该细菌与粘膜层相关并附着到胃上皮上。幽门螺杆菌感染常常在儿童期获得，通过人与人的接触或通过摄食污染的食物和水传播。细菌能够留存在胃环境中数十年，甚至是宿主的整个生命期。幽门螺杆菌感染是胃十二指肠溃疡的最强的已知风险因素，此外，是被定义为胃腺癌和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的病原体的首 要细菌。幽门螺杆菌具有许多不同的定殖和毒力决定簇。由ureA和ureB编码的脲酶通过降解菌落部位的尿素来中和胃酸度。细菌鞭毛介导运动性。VacA细胞毒素和CagA致病性岛(Pathogenicity Island)导致细胞毒性并影响上皮的生物学。最充分研究的幽门螺杆菌粘附素是结合宿主细胞糖蛋白上碳水化物结构的外膜蛋白。BabA粘附素结合岩藻糖基化血型抗原Lewis-b，唾液酸结合粘附素(SabA)结合胃上皮细胞上唾液酸化的碳水化物结构。几种其他的外膜蛋白，例如，ΗορΖ、ΗορΗ、Α1ρΑ和AlpB也显示了介导与宿主细胞的细菌附着。为了对抗由宿主免疫系统释放的反应性氧物质以及在胃粘膜中存活，幽门螺杆菌具有许多解毒蛋白质。在这些当中，烷基I-过氧化氢还原酶(AhpC，其由ahpC基因编码)是最丰富的蛋白质。AhpC是2-Cys抗氧化蛋白(peroxiredoxins)的成员，是硫氧还蛋白依赖性的。已经显示的是，相比同源于真细菌的AhpC，幽门螺杆菌的AhpC更为同源于人类抗氧化蛋白家族(Prxs)。这提示了长期的感染可能促使细菌AhpC与人类Prxs基因重组以形成人类样的AhpC。补体系统和⑶46补体系统在消除病原生物方面具有重要的作用。许多细菌发展了通过干扰补体调节因子来逃避人类补体系统机制的能力。由除红血球之外几乎所有细胞表达的一种人类细胞表面糖蛋白CD46，通过充当丝氨酸蛋白酶因子I对沉积的C3b和C4b蛋白水解作用中辅助因子来调节补体激活。CD46由四个同源的补体控制蛋白质重复序列(CCPR-1、-2、-3和-4)、丝氨酸-苏氨酸-脯氨酸(STP)-富含域、跨膜的疏水性结构域、细胞质锚定部和细胞质尾部组成。CD46的四种主要的同种型由STP结构域的可选择剪接以及两种细胞质尾部(Cyt-I和Cyt-2)之一间的选择来表达(参见Dhiman, N. , Jacobson,R.M. &Poland, G.A. Measles virus receptors SLAM and CD46. Rev Med Virol 14，217-229 (2004) ;Gill，D. B. &Atkinson，J. P. CD46 in Neisseria pathogenesis. TrendsMol Med 10，459-465(2004) ；RiIey-Vargas, R. C.，Gill，D.B.，Kemper, C.，Liszewski,Μ. K. &Atkinson，J. P. CD46 !expanding beyond complement regulation. Trends Immunol25,496-503(2004)) o CD46是腺病毒、人类疱疹病毒6、病原性的奈瑟氏菌(Neisseria)、麻疫病毒和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的受体。化脓性链球菌和淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhoeae)的上皮细胞感染触发CD46的脱落。虽然CD46在未感染的个体以及在患有胃溃疡、十二指肠溃疡和腺癌的幽门螺杆菌感染的患者的人类胃上皮中表达(Correa, P. Helicobacter pylori and gastriccarcinogenesis. Am J Surg Pathol 19Suppl I, S37-43 (1995)), CD46 在幽门螺杆菌感染中的作用尚未被阐明。 幽η螺杆菌感染的当前的治疗在有效地消灭幽门螺杆菌感染的尝试中，常规地使用三重疗法。当今，标准的三重疗法是阿莫西林、克拉霉素和质子泵抑制物，例如奥美拉唑(omeprazole)、兰索拉唑(lansoprazole)、泮托拉唑(pantoprazole)或埃索美拉唑(esomeprazole)。使用甲硝咕唑的方案也在应用中。一般地，使用的抗生素具有广泛的抗菌谱，影响天然的肠菌群，产生胃肠副作用。此外，广谱抗菌素的使用可能促进抗生素抗药性的发展，其是令人警惕的不断增 长的问题。因而，本发明的目的是提供一种不具有与当前的疗法相关的问题的幽门螺杆菌感染的药物治疗。
附图简要描述图I表示幽门螺杆菌诱导胃上皮AGS细胞中⑶46的脱落。(A)在感染后18小时野生型幽门螺杆菌J99、26695和HPGAl对AGS细胞的粘附。细菌以100的感染复数(MOI)添加。结果代表了来自三个独立实验的三份样品的平均值和标准偏差。(B)胃上皮细胞的感染触发⑶46的损失。在100的MOI下18小时，AGS细胞被幽门螺杆菌J99、26695和HPGAl感染。通过使用CD46特异性抗体的流式细胞计来分析未感染的(黑色阴影区域)和感染的AGS细胞(非阴影区域)的CD46的表达。(C)ELISA显示在幽门螺杆菌感染之后在细胞上清液中CD46的存在。微量滴定板用未感染的(对照)和感染的细胞的上清液包被24小时，用多克隆CD46抗体(H294)、随后用HRP轭合的抗IgG覆盖。结果代表三个独立实验的三次重复，误差线代表平均值土s. d(*P ( 0. 001)。图2表不⑶46结合幽门螺杆菌。(A)改编自上文的Riley-Vargas et al的OM6-BC1的细胞外区域的示意图。(B)结合细菌溶胞产物的rCD46的ELISA分析。微量滴定板用幽门螺杆菌(J99、26695、HPGA1)的溶胞产物包被，用2. 5μ grCD46或幽门螺杆菌溶胞产物分别覆盖I小时，用CD46抗体和Alexa488轭合的抗兔IgG染色。(C)结合幽门螺杆菌菌株的rCD46的流式细胞计分析。对数生长期的细菌(107CFU/ml)与SOyg/ml r⑶46孵育2小时，洗涤，用多克隆⑶46抗体、随后用Alexa 488轭合的抗兔IgG染色，之后通过流式细胞计分析。(D)幽门螺杆菌J99与r⑶46之间的相互作用可以被⑶46抗体或C3b阻断。r⑶46与缓冲液、C3b或与⑶46抗体在37°C预孵育I小时，然后与细菌孵育另外2小时。作为对照，有或者没有rCD46地孵育细菌。洗涤细菌悬浮液，用多克隆⑶46抗体和Alexa 488轭合的抗兔IgG染色，并通过流式细胞计分析。结果代表两个独立实验的三次重复，误差线代表平均值土s.d. CP ^0. 01) 0 (E)r⑶46与幽门螺杆菌结合的显微镜检测。细菌(106cfu/ml)与(+CD46)或不与(-CD46) 30 μ g/ml的r⑶46孵育2小时，洗涤，用多克隆⑶46抗体和二级抗-IgG抗体染色，之后通过倒置荧光显微镜分析。图像表示三个独立实验之一。(F)响应于⑶46结合的改变的幽门螺杆菌形态。图3表示重组的⑶46对幽门螺杆菌是杀细菌性的。(A) IO5 个细菌/ml 的幽门螺杆菌 J99 与 0、5、10、30、50 或 100 μ g/ml 纯化的 rCD46或纯化的硫氧还蛋白(Trx)在37°C在10% CO2和5% O2中孵育6小时。⑶在0、6和24小时，IO5个细菌/ml的幽门螺杆菌J99与 30 μ g/ml的rCD46孵育。活细菌通过在ColombiaBlood Agar平板上平铺连续稀释物来计数。存活百分比表示为r⑶46孵育后的集落形成单位(cfu)除以没有rCD46的对照cfu(*P ( O. 006)。(C)rCD46对细菌的渗透化作用可以被C3b阻断。rCD46与缓冲液或C3b预孵育，之后添加到幽门螺杆菌菌株J992小时。没有rCD46的纯化的硫氧还蛋白(Trx)或缓冲液用作阴性对照。细菌用PI染色，固定，通过流式细胞计分析 ΓΡ 彡 O. 001)。(D)改编自 Gill et al. (Gill, D. B. , Spitzer, D.,Koomey, Μ.，Heuser, J. E. &Atkinson，J. P. Release of host-derived membrane vesiclesfollowing pilus—mediated adhesion of Neisseria gonorrhoeae. Cell Microbiol 7，1672-1683 (2005))的CD46的CCP1-4结构域的示意图。暗色的标记是CD46内四种合成的肽Pl-P4(CCPl-4)的位置。(E)在与肽孵育后幽门螺杆菌的存活。细菌(105CFU/ml)与30 μ M的每种肽孵育6小时，连续稀释，在平板上涂布用于活菌计数。(F)在与0、5、10、20或3(^皿的Ρ3肽孵育6小时之后幽门螺杆菌(105CFU/ml)的存活。细菌连续稀释，在平板上涂布用于活菌计数。结果代表三个独立实验的三次重复，误差线代表平均值土s.d。图4表示r⑶46和肽-P3抑制幽门螺杆菌的脲酶活性(A)通过亲和层析识别幽门螺杆菌的r⑶46结合配体。通过质谱，分子量20和28kDa的两个显著的条带被鉴定为UreaseA和烧基过氧化氢还原酶(ahpC基因编码的AhpC) (B). rCD46对幽门螺杆菌脲酶活性的时程抑制作用。如在方法中指明的，通过添加含尿素的反应缓冲液来分析脲酶活性。(C)结合幽门螺杆菌J99和其突变体(AureA和AureA/AahpC)的rCD46的流式细胞计分析。细菌(107CFU/ml)与30 μ g/ml rCD46孵育2小时，洗涤，用多克隆⑶46抗体、随后Alexa 488轭合的抗兔IgG染色，之后通过流式细胞计分析。(D)结合幽门螺杆菌J99和其突变体(Λ ureA、Δ ahpC和Λ ureA/ Δ ahpC)的肽的流式细胞计分析。细菌(107CFU/ml)与20μΜ的FITC-P3、FITC-P1或随机肽(RP)孵育2小时，洗涤，通过流式细胞计分析。(E) CD46P3肽和Pl肽对幽门螺杆菌J99的脲酶活性的作用。幽门螺杆菌J99的I μ g的总蛋白提取蛋白质与30 μ M Ρ3或Pl肽孵育O到60分钟。如在方法中指明的，通过添加含尿素的反应缓冲液来分析脲酶活性。结果代表三个独立实验的三次重复，误差线代表平均值土 S. d。(*P ^ 0. 01 ；**P ( 0. 05***P ( Ο. 003)。图5表示口服CD46P3肽消除了小鼠模型中的幽门螺杆菌感染。CD46转基因小鼠(10-12只小鼠每组)用108cfu/ml的幽门螺杆菌菌株67 21口服感染，三天的间隔时间每天一次。在感染后8周，小鼠口服20μΜ 100微升Ρ3肽(+Ρ3)或PBS(-P3)治疗2周。在治疗2周后解剖小鼠胃组织，匀化来检测细菌加载量，或切片用于免疫染色。㈧未感染的对照(籲)、PBS治疗的(-P3) ( )、P3治疗的小鼠(+P3) ( O )的按照IoglO集落形成单位(CFU)/克胃组织评估细菌加载量(〇)。在感染后10周，PBS治疗的小鼠中的定殖显著地高于P3治疗的小鼠中，P ( 0. 001。(B)使用抗⑶46抗体或抗幽门螺杆菌抗体在感染后10周胃组织切片的CD46和幽门螺杆菌免疫染色。(C)用抗CD46染色的并通过软件Image J分析的胃组织中的CD46强度。与P3治疗的小鼠相比，在感染的小鼠中幽门螺杆菌感染的CD46转基因小鼠的胃组织中的CD46水平显著降低。(D)通过ELISA测量的胃组织中IL-6、TNF和IL-10的细胞因子水平。与PBS治疗的小鼠(-P3)相t匕，P3治疗的小鼠中IL-10水平提高了。在治疗的和未治疗的小鼠之间IL-6和TNF水平没有显著差异。结果代表两个独立实验，标明了每种治疗的小鼠的数量(η)，误差线代表平均值土 s. do图6表示P3肽的活性位点的测定。在与肽P-25的不同变体孵育之后幽门螺杆菌的存活。P3-25与原始的肽P3相比在N-末端具有额外的亮氨酸(L)。细菌(105CFU/ml)与30 μ M每种肽孵育6小时，连续稀释，涂布到平板上用于活菌计数。(A)覆盖肽Ρ3-25的N-末端部分(Ρ3-12)、C-末端部分(Ρ3-13)和中间部分(Ρ3-14)的肽。⑶具有连续的C-末端缺失(Ρ3-15、Ρ3-18、Ρ3-21)和连续的N-末端缺失(Ρ3-16、Ρ3-19、Ρ3-22)的肽。作为对照，使用随机肽(RP-25)。结果代 表一个实验的三次重复。定义术语“氨基酸”包括蛋白质中天然存在的氨基酸，对于氨基酸是来自生物来源还是非生物来源(例如，化学合成的)没有限制。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的，以及那些被细胞转译后修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。该术语还可以包括氨基酸类似物和氨基酸模拟物。在优选的实施方式的上下文中，该术语仅涉及天然存在的氨基酸。术语“氨基酸类似物”是指与蛋白质中天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构的化合物，即，具有α-碳(根据定义结合于氢、羧基基团、氨基基团)，但不同于天然氨基酸在于其具有非天然存在于蛋白质中的侧链(R基团)。换句话说，这样的类似物具有非天然的修饰的R基团，但是保持了与天然存在的氨基酸相同基础化学结构的肽主干。实例包括正亮氨酸、高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。术语“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但是功能与天然存在的氨基酸类似的化合物。例如，氨基酸模拟物包括β-和Y-氨基酸。在此使用的术语“肽”是指长度上没有上限的肽。换句话说，该术语还涵盖多肽和蛋白质。在优选的实施方式的上下文中，该术语仅涉及包含由肽键连接的天然存在的氨基酸的线性链的分子。然而，该术语还可以涵盖包含一个或更多个氨基酸类似物的肽。该术语还可以涵盖包含一个或更多个氨基酸模拟物的肽。该术语可以进一步包含肽模拟物和功能性衍生物。术语“突变肽”是指模板肽的变体，其中模板肽序列的一个或更多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基替代，或被删除，或一个或更多个氨基酸残基被添加到模板肽的原始序列中。具有突变肽序列的肽可以通过合成和/或通过定点诱变技术，或任何其他已知的合适技术来制备(参见，例如，Schulz, G. E. et al, Principles of Protein Structure,Springer-Verlag, New York，1978 ；or Creighton，T. E.，Proteins !Structure andMolecular Properties, W. H. Freeman&Co.，San Francisco，1983，通过引用将其合并在此)。根据本发明的突变肽的优选的改变是熟知的“保守性”取代。保守性氨基酸替换可以包括在一个组内的同义氨基酸，所述组具有足够相似的物理化学性质，在该组的成员之间的取代将保留分子的生物学功能，Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974)。明显的是，氨基酸的插入和删除也可以在上文定义的序列中进行，而不改变它们的功能，特别是如果插入或删除仅仅涉及几个氨基酸，例如，低于三十个，优选的低于十个，并且不移动或变位对于功能性构象关键的氨基酸，例如半胱氨酸残基，Anfinsen, " Principles ThatGovern The Folding of Protein Chains " , Science, VOL. 181, pp. 223-230 (1973)。这样的删除和/或插入产生的突变肽处于本发明的范围之内。 优选的同义氨基酸组在表I中所限定，其按照列的优先顺序显示。表I优选的同义氨基酸的组本发明公开了人类CD46多肽或其有效变体在治疗幽门螺杆菌感染中的用途，还公开了相关的药物以及在其制造中的用途、药物组合物、治疗方法等等。