专利名称：鸡致病性大肠杆菌traT基因探针的制作方法本专利涉及禽病研究中鸡大肠杆菌快速鉴定和诊断，对大型集约化鸡场或某一地区鸡大肠杆菌发病时，对分离获得的菌株进行致病力鉴定，以明确鸡群感染的大肠杆菌为原发性感染还是继发性感染，从而指导集约化鸡场大肠杆菌病的综合防制，给养禽业带来良好的经济效益。根据已报道的鸡大肠杆菌traT基因序列，合成引物，利用PCR技术将traT基因的核心部分扩增后，经提纯，标记地高辛，制备出基因探针，用于快速检测鸡大肠杆菌分离株的致病力。用本专利介绍的方法在2天内就能完成大肠杆菌分离株的致病性鉴定，而传统的大肠杆菌致病力鉴定方法——接种雏鸡，则需要10余天，且浪费人力、物力。本专利主要针对病死鸡和养鸡外环境中致病性大肠杆菌的快速鉴定。首先将分离菌株培养于LB肉汤，37℃水浴振荡培养过夜，取1.5ml菌悬液于离心管中，12000rpm离心3分钟弃上清，加0.1ml溶菌酶液悬浮菌体，置冰上30分钟，加0.2ml裂解液，混匀，冰浴10分钟，加0.02ml 5M醋酸铵液混匀，置冰上30分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，收集上清液，加0.05ml预冷的异丙醇混匀，置-70℃冰箱30分钟。12000rpm离心5分钟弃去上清液，沉淀加入1ml预冷无水乙醇，12000rpm离心15分钟，弃乙醇液，加20ul 1×TE液即为提纯质粒。将待检大肠杆菌的质粒提取物1ul在硝酸纤维素膜上点样，自然干燥，加适量缓冲液于68℃水浴3～4分钟进行预杂交，将标记地高辛的traT基因探针(traT-DIG)水浴煮沸5分钟，放冰上冷却后，加入杂交缓冲液，使探针的DNA浓度为5～25ng/ml，于68℃水浴杂交16小时，按常规杂交技术洗膜，按地高辛的检测试剂盒说明进行检测。本专利涉及的探针检测，结果与背景具有良好的反差效果，按常规操作即可。本专利扩增traT基因核心部分的一对引物为引物13’-CTTTCAGGGTGTGGTGCGATGAG-5’引物23’-CGAGCAACAGGTTGGGGCCTTTC-5’PCR扩增参数94℃ 1min.60℃ 1min.72℃ 1min.30次，最后一次循环结束后，72℃延伸10min.

本专利涉及致病性大肠杆菌的快速诊断和致病性鉴定，对集约化鸡场或区域性鸡场大肠杆菌分离株进行检测，以明确感染的大肠杆菌是原发性感染还是继发性感染，从而指导大肠杆菌病的综合防治。根据GenBank中报道的鸡大肠杆菌traT基因序列。合成一对引物以致病性大肠杆菌质粒为模板，利用PCR扩增出traT基因的核心部分。经提纯，标记地高辛，制备出基因探针，用于快速检测鸡大肠杆菌分离株的致病力。