专利名称：一种具抑菌活性的短肽及其应用的制作方法抗菌药物的广泛使用，大大降低了人类受细菌感染引起死亡的威胁，也产生了一些新的问题，如细菌的耐药性。致病菌的耐药性已经日益严重地威胁着人类的健康。目前多数的常规抗生素都出现了相应的耐药性致病株系，寻找全新类型的抗菌药物成为解决耐药性问题的又一课题。抗菌肽是指分布于生物体内具有抵御外界微生物侵害、清除体内突变细胞的一类小分子多肽，与抗生素不同，抗菌肽是特定基因编码的产物，它通过破坏细胞膜通透性使细胞内容物外流，最终导致细菌死亡。因此它不会使细菌产生抗药性，因而避免了超级细菌的产生。近年来，肽在人体中的作用已引起科学界的高度重视。随着医学及生化技术的发展，多肽类药物将成为21世纪重要的诊断、监测、预防和治疗药。因此，开展多肽药物的研究具有重要意义。
本发明的目的是提供一种具有显著抑菌活性的短肽及其应用。本发明所述具有抑菌活性的短肽，其特征在于所述短肽为SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。本发明提供的具有抑菌活性的短肽不需任何修饰连接，且人工合成方便；试验证明具有显著的抑菌功能，同时对正常细胞无毒性。本发明所述短肽在制备抗细菌药物中的应用。功能实验显示本发明所述短肽抗菌谱很广，无论是G+菌(革兰氏阳性菌)、还是 G—菌(革兰氏阴性菌)，都能被它很好地抑制，而且对真菌的抑制作用也很明显。提示其在抗细菌药物开发和应用方面有重要价值。进一步的功能实验显示本发明的短肽对细菌的抑制作用在IOmin之内就开始发挥，20min后抑制率即可达80%，45min后就可达到90%以上。本发明的短肽不仅抗菌作用很强，而且稳定性好，不仅在100°C煮沸lOmin，活性还能保持80%，而且在酸、碱的环境中还能发挥其良好的抑菌作用。鉴于上述短肽的性质和功能，本领域普通技术人员可以利用分子生物学技术，根据氨基酸与密码子的对应关系反推出核酸序列作为功能基因，用于制备转基因动物或植物以表达功能蛋白，并用于药物的开发和临床治疗。本发明所述短肽的设计与合成1、依据目前国际主要抗菌肽数据库(http //www. imtech. res. in/raghava/ antibp/ ；http//aps.unmc. edu/AP/main. php ；http//www. bbcm. univ. trieste. it/ ； http://penbase. immunaqua. com/)中登陆的抗菌肽的序列，分析其一级结构与活性的关系的对应关系，设计人工短肽序列。 2、利用蛋白质分析数据库http://WWW. expasy. org/分析已知活性的多肽序列与设计的多肽序列的二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。3、将设计的人工短肽序列送至生物公司合成或利用自动多肽合成仪合成序列。 HPLC检测纯度要大于96%，同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。4、合成后的多肽进行抑菌功能检测筛选。5、通过功能检测，最终获得具有抑菌功能的多肽序列，其氨基酸序列具体是:Arg Gln Lys Arg Pro Glu Arg Lys Asn Thr Gly Phe Leu Pro Glu Arg lie Pro Pro。实施例2利用液体生长抑制法检测本发明所述短肽的抑菌活性2. 1材料、试剂1)本发明所述短肽由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，氨苄青霉素 (Amp)为solarbio公司产品，一次性滤器，为美国PALL公司产品，其它药品试剂为国产分析纯。2)选用革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subti lis (Ehrenberg) Cohn)、 金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、藤求菌(Sarcina ureae)、苏云金芽 包杆菌(Bacillus thuringiensis) > 巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)；革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)、 弧菌(Vibrio)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、变形杆菌(Proteus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；真菌 爺病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜类炭疽病菌 (Colletetrichum lagenarium)、苹果炭疽病菌(Gloeosporium album)棉花黄萎病菌 (Verticillium dahliae)进行测试。3)封闭液0. 4% BSA(w/v),0. 02%冰醋酸，配制后过滤除菌。4) PB 液体培养基(PH 7. 4-7. 6)胰蛋白胨(Tryptone)10g/L氯化钠(NaCl)5g/L2.2 实验1)向无菌96孔酶标板所使用的孔中加入200 μ L封闭液，室温封闭24h。2)用PB液体培养基过夜培养上述各种细菌，转培养使细菌处于对数生长期。用 PB培养基调整菌液0D_约为0. 002。3)酶标板弃去封闭液，每孔加90 μ L步骤2)所述菌液，再加入用10 μ L无菌水配好的各种浓度梯度(浓度范围lmg/mL 60mg/mL)的本发明所述短肽。阴性对照为90yL 菌液+10 μ L无菌水；阳性对照为90 μ 1菌液+10 μ L浓度为0. 25mg/mL氨苄青霉素溶液(终浓度为 0. 025mg/mL,约 62 μ M)。4)将加好菌液和药品的酶标板置于28°C摇床，IOOrpm恒温培养。分别在培养后 0h、3h、12h、15h、24h、36h，用 BIOTEK ELX800 酶标仪测定每孔的 630nm 吸光值(OD63tl)。 5)利用SigmaplotlO和Excel软件分析处理数据。结果表明，本发明的短肽对无论是对G+菌、还是对G_菌都能被它很好地抑制，而且对真菌的抑制作用也不错；15mg/mL 50mg/mL浓度范围内，浓度越大抑菌效果越明显。提示其在抗细菌药物开发和应用方面有重要价值。实施例3以大肠杆菌(Escherichia coli)为指示菌。质量浓度为40mg/mL的本发明短肽，分别在作用大肠杆菌(Escherichia coli) IOmin, 25min, 45min, 60min 禾口 90min 后涂板。大肠杆菌抑制曲线显示本发明的短肽对细菌的抑制作用在IOmin之内就开始发挥，20min后抑制率即可达80%，45min后就可达到90%以上。实施例4以大肠杆菌(Escherichia coli)为指示菌。将本发明的短肽溶液(40mg/mL)分成8份，分别于100°C加热Omin，lmin,2min, 4min, 8min, 15min, 20min, 40min后进行抑菌实验，每个加热时间做3个平行组，同时做空白对照组。结果显示本发明的短肽在100°C加热Smin后，其抑菌活性基本上没有变；但随着加热时间的延长，抑菌活性有所降低，到15min时活性降低了约50% ；接近20min时，本发明的短肽活性几乎全部丧失；不过加热时间在IOmin以内，抑菌活性保持80%以上。


本发明公开了一种具抑菌活性的短肽，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明还公开了所述短肽在制备抗细菌药物中的应用，实验证实本发明的短肽抗菌谱广，无论是G+菌、还是G-菌，都能被它很好地抑制，而且对真菌的抑制作用也很明显，提示其在抗细菌药物开发和应用方面有重要价值。