专利名称：用于治疗干眼和/或角膜和结膜损伤的药剂的筛选方法以及该方法制得的药物组合物的制作方法DEWS R印ort(2007)是由70名干眼的国际专家做出的现今干眼知识的综述，并且DEWS的小组委员会提供了干眼的详细报告，包括定义和分类、流行病学、诊断和监测、以及管理和治疗。该报告公开于“The Ocular Surface, (APRIL 2007，V0L5，NO. 2pp. 65-204) ”(非专利文献1，通过引用并入本文)中，且可在网站(www. tearfilm. org) 上浏览到。根据DEWS R印ort(2007)，干眼具有如下定义(参见“The Definition andClassification of Dry Eye Disease”(p75_92))干眼是对眼表面具有潜在损害的导致不适、视力障碍和泪膜不稳定性的症状的眼泪和眼表面的多因素疾病。其伴有泪膜的渗透压升高和眼表面的炎症”。由于干眼被如上定义为一种多因素疾病，因而干眼的治疗根据其情况和症状而不同。DEWS Report (2007)将干眼严重度分为四个级别(参见“Management and Therapyof Dry Eye Disease”(pl63_178)和表2(pl73))并提供了各种严重度的治疗建议(参见“Management and Therapy of Dry Eye Disease，，和表 4 (pl74))。根据DEWS Report (2007)，对于干眼严重度I和2，存在不少推荐药剂。但是，对于干眼严重度3以上、特别是例如角膜和结膜等眼表面损伤，并没有除血清以外的其它推荐药剂。而且，血清应当是来源于待治疗患者的血液的(即，自体血清)，并且在对眼给予时应当进行适度稀释。目前，尚不存在对于根据DEWS R印ort (2007)的干眼严重度3以上的干眼有效的药剂。因此，需要建立代表根据DEWS Report (2007)的分类的干眼、特别是根据该报告的干眼严重度为3以上的干眼、尤其是角膜和结膜等眼表面损伤的的动物模型。此外，通过将该动物模型用于药物筛选，可期望提供一种可用于根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上、特别是角膜和结膜等眼表面的损伤的药物组合物。现有技术文献[非专利文献]The Ocular Surface, (APRIL 2007, V0L5, NO. 2 pp. 65-204)
发明要解决的技术问题本发明的目的是提供用于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的药剂的筛选方法。此外，本发明的目的还在于提供治疗如上定义的干眼和/或角膜和结膜损伤的药物组合物。用于解决技术问题的方法本申请提供以下发明(I)用于治疗根据国际干眼研究会报告(DEWS Report) (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的药剂的筛选方法，其包括通过向兔眼中滴注正庚醇溶液来制作具有角膜和结膜上皮磨损的角膜和结膜损伤模型兔；和对所述模型兔的眼给予试验药剂并确定所述试验药剂的修复角膜组织的效果。 (2)用于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的药物组合物，其包含通过(I)的方法获得的药剂。(3)如⑵所述的药物组合物，其中所述药剂为人白蛋白。(4)用于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的药物组合物，其包含人白蛋白作为活性药剂。(5)如⑷所述的药物组合物，其中人白蛋白为人血清白蛋白。(6)治疗干眼和/或角膜和结膜损伤的方法，其包括对患有根据DEWSReport (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的患者给予有效量的通过(I)的方法获得的药剂。(7)治疗干眼和/或角膜和结膜损伤的方法，其包括对患有根据DEWSReport (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的患者给予有效量的人白蛋白。(8)通过(I)的方法获得的药剂用于制造药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤。(9)人白蛋白用于制造药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗根据DEWSReport (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤。发明效果根据本申请，变得可以提供用于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的药剂的筛选方法。根据本申请的筛选方法所确定具有修复角膜组织的效果的药剂可用于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤。进而，根据本申请，变得可提供使用该药剂治疗根据DEWSReport (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的方法。 不适，严重度&轻度和/或在中度、间歇性重度、频繁或重度和/或失 频率外界压力下或慢性、有压持续性、无压明和持续性__间歇性发生力或无压力____ 视觉症状无或间歇性恼人和/或间恼人、慢性和持续性和/或 轻度疲劳歇性活动受/或持续性活可能失明
_____动受限__
结膜充血无到轻度无到轻度+/-__+/-H-
结膜染色无到轻度不定中度到显著显著角膜染色无到轻度不定中央显著重度点状糜 (严_位置)_____烂
角膜/眼泪征兆无到轻度轻度残渣丝状角膜炎丝状角膜炎
I月形物粘液凝结粘液凝结， t眼泪歹曳渣个眼泪歹嫌，
____溃癌
眼睑/睑板腺 MGD不定地MGD不定地频繁倒睫，角质
__存在__存在___化，睑球粘连
TFBUT(秒)____^lO__^5__立即
Schirmer 分数不定 <10 ^5 ^2 (mm/5min)____*必须有征兆和症状。TBUT :荧光素眼泪分解时间。MGD:睑板腺疾病这里的“根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤”指的是对应于根据上述分类的干眼严重度为3以上的干眼，和/或表现出这种干眼的任何征兆和症状的角膜和结膜损伤。 此处所用的“约”在与任何数值数目使用时，指的是+/-30 %和+/-20 %，并且优选+/_10%。本申请的筛选方法中所用的角膜和结膜损伤的模型兔通过向兔眼滴注正庚醇来制作。一般来说，模型兔可如下制作利用麻醉剂的肌肉注射、然后利用局部麻醉剂的眼部给药来对兔子进行麻醉，将正庚醇溶液滴注到兔子的一眼中，以使正庚醇溶液覆盖角膜和球结膜，并迫使兔子眨眼。本发明中所使用的兔子的品种可以但不限于新西兰白兔、日本白兔和荷兰兔，其中优选新西兰白兔。通过肌肉注射给药的麻醉剂可包括氯胺酮、甲苯噻嗪和美托咪定，并且优选组合使用氯胺酮和甲苯噻嗪。用于眼部给药的局部麻醉剂可以包括奥布卡因、利多卡因和布比卡因，并且优选使用奥布卡因。滴注到眼中的正庚醇溶液是只含有正庚醇的溶液，或者是正庚醇和乙醇的混合液。优选为正庚醇和乙醇的混合液，因为其具有提高的亲水性并且可以容易地覆盖眼表面和有效地导致损伤。正庚醇和乙醇的比例为约9 I-约7 3，优选为约8 2。正庚醇溶液的使用量总计为约0. 01-约0. 1ml，优选为约0. 03-约0. 05ml，并且优选分数次滴注(2_4次)以使正庚醇溶液有效地覆盖角膜和球结膜。在对眼滴注正庚醇后，迫使兔子眨眼(1-5次，优选2-4次)，并且迫使闭眼数分钟(约0.5-约5分钟，优选约I-约3分钟)。结果，发生了角膜和结膜上皮磨损。根据本发明，可制作稳定的角膜和结膜损伤模型。
通过使用本发明的角膜和结膜损伤的模型兔来测定试验药剂的修复角膜组织的效果，可以筛选对于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的药剂。本发明的筛选方法中，眼部给药的试验药剂的频率通常但不限于每天1-6次。为了确定试验药剂在修复角膜组织方面的效力，每天眼部给药的频率优选较低，并且通常优选每天2次。试验药剂眼部给药的持续时间根据各种因素例如试验时机和兔子的品种而不同。通常，试验药剂的效果可以在其眼部给药开始起10天内确定。通常，试验药剂修复角膜组织的效果可以如下确定。通过在滴注正庚醇溶液之前和之后；在每天第一次给予试验药剂之前；在第4、5和6天各自第二次给予试验药剂之后；在最后给予试验药剂后的次日用染料对眼进行染色来观察角膜和结膜的状态。染色用染料可以包括荧光素、玫瑰红和丽丝胺绿，并且优选使用荧光素。角膜损伤程度是通过观察和拍摄角膜染色的状态来评分。高染色分数代表高度角膜损伤，低染色分数代表低度角膜损伤。可以使用任何常规的方法来评分，比如，将角膜分为五个区域(中央、上部、颞部、鼻部、下部区域)，各区域的染色强度用3分满分来评分，将总分数(满分15)用于评价。无染色的染色强度评分为0分；部分染色为I ;大约三分之二的区域染色为2 ;全部染色为3。在本发明中，当每次观察角膜和结膜时采用试验药剂进行眼部给药的眼部角膜损伤程度所表现的染色分数与眼部施用盐溶液的眼部角膜损伤程度所表现的染色分数之间具有显著差异时，确定为试验药剂修复角膜组织的效果显著，并且显著性水平小于5%。显著性差异可以通过任何合适的方法确定，例如通过Paired-Student’ s t检验来确定。对于DEWS Report (2007)中干眼严重度为1、2或3的每种推荐药剂，通过采用本发明中角膜和结膜损伤的模型兔子来确认其修复角膜组织的效果。DEWS Report (2007)中推荐的对于干眼严重度为I和2的药剂，例如用于干眼严重度为I的包括粘性组份(Hyalein. 迷你眼药液0. 3% :Santen Pharmaceutical (Japan):日本批准)的配方或者包括电解液(Cationorm : :Novagali Pharma (France) :EU批准)的配方，和用于干眼严重度为2的包括消炎剂(Restasis =Allergan(US):美国批准)的配方，以上这些推荐的药剂并没有表现出在修复角膜组织方面的显著效果。另一方面，对于干眼严重度为3所推荐的血清(人血清池Kohjin Bio(Japan))表现出在修复角膜组织方面的显著效果。因此，本申请中通过利用具有角膜和结膜损伤的模型兔子来确定修复角膜组织效果这一方法在筛选用于治疗DEWS Report (2007)中干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的有效药剂方面是有用的。此外，通过本发明的筛选方法，显示出人血清白蛋白在本发明的角膜和结膜损伤的模型兔中具有显著的修复角膜组织的效果，与DEWS Report (2007)中推荐用于干眼严重度3的药剂(血清)相似。因此，认为人白蛋白可用于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤。本发明中，人白蛋白优选为人血清白蛋白。只要具有通常的医疗目的用纯度，则本发明中可使用任意的人血清白蛋白。特别优选通过电泳法分析时含有80%以上的白蛋白。另外，优选受到加热处理以使病毒等失活。具体地，优选市售作为药品的人血清白蛋白。由微生物制造的重组人血清白蛋白也优选用于本发明。使用基因重组技术制备重组人血清白蛋白的方法是本领域公知的。例如，制备含有编码人血清白蛋白的基因的载体并将其导入宿主细胞，以使该细胞转化。然后，选择并培养产生人血清白蛋白的转化细胞，并从该细胞或其培养基中分离并纯化人血清白蛋白。宿主细胞可以包括本领域中常用于蛋白质生产的微生物，例如酵母和大肠杆菌。酵母的实例可包括属于以下属的酵母克鲁维酵母属、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属,特别优选使用乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母、毕赤酵母。更 优选使用乳酸克鲁维酵母CBS2360菌株、酿酒酵母AH22菌株(a，his4，leu 2，can I)和毕赤酵母GTS115菌株(his4)作为宿主酵母。此处所用的术语“治疗”是指任何控制症状的方式，包括症状的预防、治愈和缓解，以及症状发展的停止或缓解。本发明的药物组合物可以是用于局部给药至眼的任何剂型。特别优选眼用溶液剂或滴眼剂。在本发明的组合物被制剂为含有人白蛋白为活性成分的眼用溶液剂的情况中，该组合物可以含有约l-1000mg/ml (0. l-100w/v% )量的人白蛋白，更优选约IO-IOOOmg/ml (l-100w/v% ),并且特别优选约10-250mg/ml (l-25w/v% )。该组合物中可以进一步含有可药用稀释剂。此处使用的“可药用稀释剂”可以是本领域技术人员已知用于眼用组合物的任意稀释剂，例如水、生理盐水、人工泪液等。本发明的药物组合物可以进一步包含通常用于眼用组合物的各种成分，例如稳定剂、灭菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH调节剂、表面活性剂等。当组合物制剂为眼用溶液剂或滴眼剂时，组合物的PH优选调节为5-8。对于单次给药，本发明的药物组合物可以以约I-约IOOiU/眼，优选约10-约50 Ul/眼，更优选约30-50 U I/眼的量进行给药。在不同的方面，本发明提供人白蛋白用于制造药物组合物的用途，该药物组合物用于治疗根据DEWS Report (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤。在又一不同的方面，本发明提供治疗根据DEWS R印ort (2007)的干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的方法，其包括对有需要的对象给予有效量的人白蛋白。在本发明的这些方法中，人白蛋白的“有效量”是理想的治疗所需的量，并且可以根据的患者症状、年龄、性别、体重、饮食、组合使用的其它药物以及医学领域中技术人员所了解的各种因素而选择最适量。除了上述因素，该有效量还可以根据人白蛋白的种类或活性而不同。在本发明的这些方法中，药物组合物可以以约I-约IOOii I/眼，优选约10-约50 yl/眼，且更优选约30-50 u I/眼的量给药约I-约20次/天，优选1-10次/天，但这并不意欲限定本发明的范围。本发明中所用的药物组合物可以与其它药物活性化合物联合给药，只要其不妨碍本发明的效果。该术语“联合给药”可以包括在给予本发明的药物组合物之前、同时、和之后给予其它药物活性化合物。当其它药物活性化合物与本发明的药物组合物同时给药时，本发明的组合物和其它化合物可以一起制剂为单一的剂型，或者分别制剂为不同的剂型。例如，人工泪液，硫酸多糖比如透明质酸和硫酸软骨素、环孢素、谷胱甘肽、黄素腺嘌呤核苷酸钠、皮质类固醇、四环素、维生素A(视黄醇)及其衍生物比如包括棕榈酸视黄醇酯和乙酸视黄醇酯的维生素A酯、以及细胞生长因子比如肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍化生长因子O3DGF)、转化生长因子(TGF-a和TGFj )和角化细胞生长因子(KGF)可以与本发明的药物组合物联合给药。
参考以下所示试验例进一步说明本发明。该试验例不应以任何方式用于限制本申请的范围。[实施例]试验例I(角膜和结膜损伤模型的制作)兔子(std :NZW)通过肌肉注射氯胺酮(10mg/kg)和甲苯噻嗪(4mg/kg),然后通过眼部给予0.4%的奥布卡因(每眼两滴)进行麻醉。将兔子保持横卧放置并向一只眼中滴注临用前制备的0.04ml (0.01ml X4次)正庚醇溶液(正庚醇乙醇=8 2)，以使正庚醇溶液覆盖角膜和球结膜。然后，迫使该兔子眨眼3次并在第三次眨眼后闭眼2分钟。对两只眼睛均进行上述程序。由此，制作角膜和结膜损伤模型。(试验药剂的给予)从角膜和结膜损伤模型的制作日开始，每天重复给予血清或0.3%透明质酸钠制齐IJ2次，给予10天。对未给予试验药剂的眼以同样的方式给予盐水溶液。它们均以50 Ul/眼/次的体积来给予。作为血清使用时，通过过滤(MILLEX GV，PVDF，0. 22 u m，MILLIP0RE)对人血清合并物(Kohjin Bio (日本))进行灭菌，并根据已知方法使用盐水稀释5倍以制备血清眼用溶液，该血清眼用溶液被用于干眼的自体血清疗法。所述0. 3 %透明质酸钠制剂为Hyalein :迷你眼用溶液(SantenPharmaceutical(Japan))。(试验组)[表2]
H试验药剂眼睛的数目(例数)
ISi6眼(6只动物)
—20. 3%透明质酸钠制剂 6眼(6只动物)
兔子通过体重上的随机分层分配到各组。(角膜损伤的确定)在正庚醇溶液 治疗之前(试验药剂初次给药的前一天)；正庚醇溶液治疗后即刻；试验药剂每天第一次给予之前；试验药剂在第4、5和6天各自第二次给予后；以及试验药剂最终给予后一天，对角膜和结膜的状态进行了观察。将2iU的I %萤光素滴入眼中，2分钟后，通过在发光部具有钴蓝滤光镜(FUJIFILTER BPB45)、在镜头之前具有黄色滤光镜(FUJI FILTER SC52)的数码显微镜(VHX-900，KEYENCE CORPORATION(日本))，对角膜和结膜的染色进行拍照和观察，然后对角膜损伤的程度进行评分。对于评分，将各角膜分为5个区域(中央、上部、颞部、鼻部、下部区域)，各区域的荧光素染色强度以3分满分进行评分，将总分(满分15分)用于评价。无染色时染色强度被评分为0 ;部分染色为I ;约三分之二区域的染色为2 ;全部染色为3。该I %萤光素通过将突光素钠盐溶于盐水来制备。(结果)正庚醇溶液治疗后的角膜的荧光素染色评分示于表3。所有动物中，正庚醇溶液治疗之前的荧光素染色的评分均为O。如表3所示，在给予了血清的眼中，在治疗损伤的第4天观察到显著的修复角膜上皮的效果(P < 0. 05)。另外一方面，0. 3%透明质酸钠的给药中未观察到修复角膜上皮的效果。


本发明提供用于治疗国际干眼研究会报告(DEWS Report)(2007)中干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的药剂的筛选方法，以及含有该药剂的药物组合物。本发明进一步提供采用该药剂治疗DEWS Report(2007)中干眼严重度为3以上的干眼和/或角膜和结膜损伤的方法。