专利名称：抗kdr单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用的制作方法 恶性肿瘤是我国攻关的重要疾病之一，而肿瘤血管新生是肿瘤生长和转移的基础，当实体瘤生长超过1mm-2mm直径时，必需新生血管的介入和维持，否则将引起肿瘤的坏死、凋亡或处于休眠状态而无法继续生长或发生转移。血管新生是由一系列促血管生成、抑制血管生成正负调节因子共同调控、维系的动力学平衡过程。目前已分离纯化的血管生成因子及相关因子达20种以上，而迄今研究证明，肿瘤血管新生中唯一具有特异性的关键性调节因子是血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。在绝大多数恶性肿瘤中均呈现VEGF及其受体Flt-1，KDR/Flk-1的高表达，从而形成旁分泌/自分泌作用方式，促进内皮细胞分裂、增殖，诱导血管新生，并直接作用于肿瘤细胞，刺激肿瘤细胞生长。KDR作为血管内皮细胞生长因子主要受体之一，在介导VEGF的内皮细胞增殖、迁移、分化、微管形成、血管通透性增加等一系列生物活性中起重要作用。KDR几乎完全表达于被激活的内皮细胞(如肿瘤位点)，是一个高特异性的肿瘤治疗靶点。通过抑制肿瘤相关血管新生，最终可以达到抑制肿瘤生长、转移的目的。KDR属酪氨酸蛋白激酶第III亚型，在其7个胞外配基结合区中区域III对VEGF的结合作用最为突出。本申请人在〖高技术通讯〗2002年12卷5期第45-49页发表了一篇关于“KDR胞外III区融合蛋白(含Etag尾短肽)的重组表达”的文章，本申请对KDR胞外III区融合蛋白简称为KDRIII。还在〖免疫学杂志〗2003年19卷3期第193-197页发表了一篇关于“采用KDRIII重组蛋白作为抗原免疫小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备出1株特异性强，效价高的抗人VEGF受体KDR胞外III区单克隆抗体Ycom1D3”的研究报告。表明抗人VEGF受体KDR胞外III区单克隆抗体Ycom1D3与脐静脉内皮细胞表面KDR抗原特异性结合，并有效阻断VEGF165对脐静脉内皮细胞的刺激增生作用。但是，鼠源单抗作为异种蛋白应用于人体时产生的人抗小鼠抗体(humananti-mouse antibody，HAMA)反应，是限制其应用的重大缺陷。正是由于这一原因，80年代开始利用基因操作技术对鼠源性单抗进行人源化改造，力求在保持亲代抗体生物活性的同时，降低免疫原性。单链抗体(ScFv)是由接头(linker)将轻链可变区和重链可变区基因以两种取向(VL-Linker-VH，VH-Linker-VL)连接起来，从而可以构建具有特异性抗原结合功能的小分子片段。它具有分子量小，穿透能力强，异源性小，构建周期短，表达后的效果好，易于大量生产等优点。
本发明的一个目的在于提供一种抗KDR单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的抗KDR ScFv片断，能够降低鼠源性抗KDR抗体的免疫源性。本发明的另一个目的在于抗KDR ScFv片断在制备用于血管新生疾病(尤其是恶性肿瘤)的诊断和治疗药物中的应用。本发明涉及的抗KDR单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因，其中，所述的重链可变区基因的全长为351bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，所述的轻链可变区基因的全长为333bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO4所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，本发明的有益效果和优点是本发明采用通用兼并性引物，从分泌抗KDR抗体的杂交瘤细胞中克隆到抗KDR单克隆抗体Ycom1D3的轻重链可变区基因，并通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入柔性短肽(Gly4Ser)3，体外构建Ycom1D3-ScFv基因，经过转化和筛选，将其克隆至pAYZ表达载体，在大肠杆菌16C9中进行表达，表达产物为包涵体。复性后的ScFv产物保留了亲代鼠源性抗体的结合活性，能特异性地与可溶性KDRIII蛋白及表达KDR抗原的HUVEC细胞相结合，并可竞争性抑制VEGF165与可溶性KDRIII的结合，故而无论是作为靶向诊断治疗的载体，还是作为双功能或双特异性抗体的一臂，均具有广泛的应用前景。

附图1 实施例2抗KDR ScFv表达载体pAYZKDR ScFv结构示意图。
附图2 实施例3抗KDR ScFv的SDS-PAGE凝胶电泳分析图。
图中1 Marker，2流出液，3粗提液，4纯化后抗KDR ScFv(复性后)。
附图3 实施例3 Westernblot分析鉴定图。
图中1 Prestained Marker，2粗提液，3流出液，4纯化后抗KDR ScFv(复性后)。
附图4 实施例4抗KDR ScFv与可溶性KDRIII的直接结合实验结果图。
附图5 实施例4抗KDR ScFv竞争抑制VEGF165与可溶性KDRIII结合实验结果图。
附图6 实施例4竞争性免疫荧光抵制实验结果图之一——阴性对照。
附图7 实施例4竞争性免疫荧光抑制实验结果图之二——阳性对照。
附图8 实施例4竞争性免疫荧光抑制实验结果图之三——抗KDR ScFv。

以下列举部分实施例仅对本发明进行具体的说明，但并不限制本发明。
实施例1、抗KDR抗体轻重链可变区基因的克隆1、总RNA提取采取异硫氰酸胍一步法(Chomczynski P，Sacchi N，Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformextraction.Anal.Biochem.1987，162156)提取总RNA，2、逆转录取2μg总RNA置于0.5ml Eppendoff管中，依次加入5×RTbuffer，0.1M DTT，100ng随机引物，4×dNTP各10nmol，Rnasin 20U，于65℃水浴5-10min，然后加入200U的M-MLV逆转录酶，37℃水浴放置1h，转移至72℃水浴放置10min。
3、轻重链可变区基因PCR扩增取逆转录产物8μl置于PCR管中，依次加入10mM dNTP 2μl，10×PCR buffer 10μl，Pyrobest DNA聚合酶2U，分别采用通用兼并性引物P1、P2，P3、P4各30pmol特异性扩增抗体重链和轻链可变区基因，并在5′端和3′端分别引入MulI和NotI限制性内切酶酶切位点，加水至终体积100μl，进行PCR扩增。反应条件为95℃预变性5min后，再进行30循环的PCR扩增(94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸2min)，最后于72℃延伸10min。纯化回收PCR扩增VH，VL基因片断，经酶切后组装到pAYZ载体，转化E.Coli16C9感受态细胞。随机挑取20个克隆，进行菌落PCR，电泳鉴定阳性菌。
4、序列分析各挑取4个阳性克隆采用荧光引物标记的双脱氧末端终止法测序，并参照测序和基因序列分析(PDB)库中抗体特征对氨基酸序列进行分析，区分抗体轻链、重链框架区(FR)和抗体互补决定区(CDR)。结果显示所挑取的VH，VL克隆基因序列均一致，VH基因全长351bp，编码117个氨基酸，VL基因全长333bp，编码111个氨基酸，该基因完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列为抗体基因序列。
实施例1所使用的通用兼并性引物P15′-CTA，CAA，ACG，CGT，AGG，TC(G)A(C)，AA(G)C，TGC，AGC(G)，AGT，CA(T)G，G-3′(Mul I)P25′-GCG，TCA，TTC，GCG，GCC，GCT，GAG，GAG，ACG，GTG，ACC，GTG，GTC，CCT，TGG，CCC，C-3′(Not I)P35′-CTA，CAA，ACG，CGT，GAC，ATT，GAG，CTC，ACC，CAG，TCT，CCA-3′(Mul I)P45′-GAG，TCA，TTC，TGC，GGC，CCG，TTT，C(T)AT，C(T)TC，CAA(G)，CTT，G(T)GT，CCC-3′(Not I)实施例2、单链抗体基因表达载体pAYZKDR ScFv的构建根据轻、重链可变区的酶切图谱及构建载体pAYZ的酶切位点，设计并合成了用于VH，VL基因扩增和拼接的引物。首先分别采用引物P5、P6及P7、P8扩增重链、轻链可变区基因，再用overlap-PCR方法将抗体轻、重链可变区基因用一编码(G4S)3短肽的DNA片段拼接成5′VH-Linker-VL3′片段，最后使用P5和P8扩增全长ScFv基因，并在5′端和3′端分别引入Mul I和Not I限制性内切酶酶切位点，通过酶切，将全长ScFv基因装到pAYZ表达载体，构建如图1所示的抗KDR ScFv表达载体pAYZKDR ScFv。
以上三个PCR扩增反应程序均为94℃5min，一个循环；94℃60s，55℃90s，72℃90s，30个循环；72℃7min，一个循环。
实施例2所使用的引物P55′-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3′(Mul I)P65′-ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGG-3′P75-GGCTCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCT-3′P85′-CGGCGCACCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3′(Not I)实施例3、抗KDR ScFv抗体片段的表达、纯化及复性1、抗KDR ScFv抗体片段的表达用构建的pAYZKDR ScFv质粒转化E.Coli 16C9，挑取单菌落接种于5ml含氨苄青霉素100mg/L的2×YT培养基(每1000ml含蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，pH7.4)，37℃，250rpm，振荡培养10h；4000rpm，4℃离心10min收集菌体，重悬于20ml含氨苄青霉素100mg/L的诱导培养基(每1000ml含葡萄糖15g，酪氨酸蛋白水解物11g，酵母抽提物0.6g硫酸镁0.19g，氯化铵1.07，氯化钾3.73g，氯化钠1.2g，1mol/L三乙醇胺120ml，pH7.4)，30℃，250rpm，振荡培养24h；8000rpm、4℃离心10min收集菌体。
菌体沉淀重悬于1/30培养体积的冰预冷50mmol/L Tris-HCl、100mmol/LNaCl、1mmol/L EDTA、PH7.0，超声破碎细胞，13000rpm，4℃离心30min，沉淀用3M尿素，50mmol/L Tris-HCl(PH7.0)洗涤，13000rpm，4℃离心30min收集包涵体，包涵体溶解于6M盐酸胍和0.1mol/L Tris-HCl(PH7.0)中，4℃摇动过夜。4℃13000rpm离心30min去除沉淀，上清用于纯化。
2、抗KDR ScFv抗体片断的纯化和复性a.3倍柱床体积的Start buffer(6 M盐酸胍，0.1 M Tris-HCl，PH7.0)平衡柱后，上样，20倍柱床体积的6 M尿素，50mmol/L Tris-HCl，20mmol/L咪唑，PH 7.0洗柱，用10倍柱床体积的含250mmol/L咪唑，6 M尿素，50mmol/LTris-HCl，PH 7.0洗脱结合在镍柱上的ScFv。
b.洗脱样品在TEA缓冲液(0.4 M精氨酸-HCl，0.1 M Tris-HCl，2mmol/LEDTA，PH 7.0)透析复性过夜，.继续用PBS透析24h。
c.12％SDS-PAGE电泳及Westemblot分析鉴定经15％SDS-PAGE凝胶电泳分析，显示出分子量约为30kDa的表达带，与预期的分子量一致，Westemblot结果证明条带为表达产物，如附图2、3所示。
实施例4、抗KDR ScFv抗体活性测定1、抗KDR ScFv与可溶性KDRIII的直接结合活性采用间接ELISA方法常规进行，实验步骤简述如下将纯化KDRIII蛋白(由本室制备)用0.05mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(PH9.6)稀释成4μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜。封闭后，加入不同浓度的抗KDR ScFv，100μL/孔，室温孵育2h，弃上清液，加入按效价稀释好的鼠抗Penta-His抗体，室温反应2h后，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG，50μL/孔，室温孵育45min，OPD避光显色，加入2mol/L H2SO4终止反应，反应后的酶标板置酶标测定492nm吸光度。
如图4所示的实验结果表明，抗KDR ScFv能与可溶性KDRIII特异性结合，且结合强度与抗KDR ScFv片段的浓度呈正相关。
2、竞争抑制实验在上述证明抗KDR ScFv能特异结合KDRIII的基础上，进一步采用竞争性抑制实验考察抗KDR ScFv阻断VEGF165与可溶性KDRIII结合的活性。取不同浓度梯度的抗KDRIII ScFv各100μl分别与固定量的含E tag尾短肽的KDRIII融合蛋白(50ng)相混合，室温孵育1h。将混合物转入预先包被有VEGF165(200ng/孔)的96孔板，继续室温孵育2h，PBS充分洗涤，加入按效价稀释好的抗E tag-HRP抗体。室温反应1h后，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG，50μL/孔，孵育45min，OPD避光显色，2mol/L H2SO4终止反应。反应后的酶标板置酶标仪中检测反应结果。
如图5所示的检测结果表明随着单链抗体片断浓度的提高，VEGF165与KDRIII的结合逐步降低，表明抗KDR ScFv能竞争性抑制VEGF165与KDRIII的结合。
3竞争性免疫荧光抑制试验取HUVEC制成5×107细胞悬液，加样于40孔细胞培养板，2×106细胞/孔，抗KDR单克隆抗体Ycom1D3 40μl(1mg/ml)，阴性对照组加40μl PBS，4℃孵育1h，2600×g，4℃离心8min，弃上清液，PBS洗细胞2次，加纯化后抗KDRScFv200μl(1mg/ml)，阳性对照组加PBS，4℃放置1h，2600g，4℃离心8min，弃上清液，PBS洗细胞2次，将细胞重悬于30μl按效价稀释好的羊抗鼠IgG-FITC溶液，4℃孵育45min，PBS洗去未结合的荧光抗体，流式细胞仪测定鼠源性单克隆抗体Ycom1D3结合HUVEC细胞的阳性率。
以PBS作为阴性对照的实验结果如图6。单抗Ycom1D3与KDR表达阳性HUVEC细胞结合的实验结果如图7，结合阳性率为90.30％。经抗KDR ScFv竞争后，Ycom1D3与HUVEC细胞结合的实验结果如图8，结合阳性率为47.83％。图6-8的实验证明抗KDR ScFv可竞争性抑制Ycom1D3与HUVEC细胞结合，即抗KDR ScFv能够与KDR抗原特异性结合。
序列表<110>中国医学科学院血液学研究所<120>抗KDR单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用<160>4<210>1<211>117<212>PRT<213>小鼠(musculus)<220>
<400>1Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Gln Pro Ser1 5 10 15Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr20 25 30Arg Phe Asp Ile His Trp Val Alg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Arg Gly Asn Thr Asp Tyr Asn50 55 60Ala Ala Phe Ile Ser Gly Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys65 70 75Ser Gln Val Phe Phe Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr80 85 90Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Lys Arg Asp Gly Tyr Ala Met Asp95 100 105Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115<210>2<211>351<212>DNA<213>小鼠(musculus)<220>
<400>2caggtgcagc tgcaggagtc tggacctgac ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60acctgcacag tctctggttt ctcattaact aggtttgata tacactgggt tcgccagtct 120ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtc gtggaaacac agactataat 180gcagctttca tatccggact gagtatcagc aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240agaatgaaca gtctacaaac tgatgacaca gccatatact actgtgtcag aaaaagggat 300
ggctatgcta tggactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a<210>3<211>111<212>PRT<213>小鼠(musculus)<220>
<400>3Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu1 5 10 15Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser20 25 30Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser50 55 60Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr80 85 90Tyr Cys Gln His Ile Arg Gly Ala Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr95 100 105Lys Leu Glu Ile Lys Arg110<210>4<211>333<212>DNA<213>小鼠(musculus)<220>
<400>4gacattgagc tcacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc60atctcataa gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct180ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat240cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattagggg agcttacacg300ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgg


本发明公开了抗KDR单克隆抗体Ycom1D3重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备用于血管新生疾病(尤其是肿瘤血管新生)的诊断和治疗药物中的应用。本发明制备的抗KDR ScFv保留了鼠源性单克隆抗体对KDR抗原的识别功能，并可竞争性抑制VEGF与可溶性KDR的结合，无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能或双特异性抗体的一臂，均具有广泛的应用前景。