一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法

沈寅初, 王威, 薛亚平, 郑裕国

2012年9月12日

2012年4月13日

2012年4月13日

浙江工业大学

C12Q1/04GK102660632SQ201210110398

羟酸 脱氢酶 选择性 立体

1.一种立体选择性a -羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括 (1)取被测含有a-羟酸脱氢酶的样品溶于pH为5 9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的a -羟酸的手性单体作为底物至底物终浓度为I IOOmM,于20 50°C水浴中进行转化反应；2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中转化液呈现红棕色时，所述方法进一步包括步骤(3)和(4) (3)另取转化液显红棕色的待测样品溶于pH为5 9的缓冲液中，添加立体构型与步骤(I)相反的手性单体作为底物至底物终浓度为I IOOmM,于20 50°C水浴中进行转化反应; (4)取转化液添加2，4-二硝基苯肼溶液进行显色反应20 90min，反应结束后，若有黄亮色絮状沉淀生成，且加入NaOH溶液后，黄亮色的絮状沉淀变成颜色均一的红棕色溶液，则表明待测样品中含有的a-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若显淡绿色，表明待测样品中含有与步骤(I)底物的立体构型一致的a-羟酸脱氢酶3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述扁桃酸及其衍生物为下列之一(I)扁桃酸，(2) 2-氟扁桃酸、(3) 2-氯扁桃酸、(4) 3-氯扁桃酸、(5) 4-氟扁桃酸、(6) 4-氯扁桃酸、(7) 4-溴扁桃酸、(8) 2,4-二氟扁桃酸、(9) 3, 5-二氟扁桃酸，(10)苯基乳酸4.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述pH为5 9的缓冲液为pH7. 5 8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液5.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述2，4_二硝基苯肼溶液为浓度为0.5 6mM的盐酸或硫酸溶液，其中2，4- 二硝基苯肼的浓度为0. 01 5mM6.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述NaOH溶液浓度为0.I 5M7.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述待测样品为微生物菌体，所述方法如下 (A)取待筛选的微生物菌体均匀分散于pH = 6. 0 9. 0的磷酸缓冲液中，制成0D600值为5 10的菌悬液，添加结构如式(I)所示a -羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为I IOOmM,于20 50°C水浴中进行反应，取转化液添加0. 2 3mL的2，4- 二硝基苯肼溶液进行反应20 90min，反应结束后继续加入3 IOmL的NaOH溶液，显红棕色的为a-羟酸脱氢酶阳性样品，显淡绿色的为a-羟酸脱氢酶阴性样品；(B)另取a-羟酸脱氢酶阳性样品两份，溶于pH 7. 5 8. O的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，各自添加手性的结构如式(I)所示的R-或S-a-羟酸单体进行对照，所添加的R-或S- a -羟酸终浓度为I IOOmM,于20 50°C水浴中进行反应，分别取转化液添加.2,4- 二硝基苯肼溶液进行反应20 90min后，继续加入NaOH溶液进行显色，若仅有一份转 化液显红棕色，表明样品中所含的a-羟酸脱氢酶的光学选择性与呈红棕色样品中添加的手性a-羟酸的立体构型一致，两份转化液均显红棕色表明样品中所含的a-羟酸脱氢酶没有光学选择性； 上述步骤(A)和⑶中，所述2，4- 二硝基苯肼溶液为浓度为0. 5 6mM的盐酸或硫酸溶液，其中2，4- 二硝基苯肼的浓度为0. 01 5mM ;所述NaOH溶液浓度为0. I 5M

本发明涉及ー种立体选择性α -羟酸脱氢酶的筛选方法(ニ)