棉花pmc单染色体分离及其特异分子标记建立的方法_刘方专利（pmc,特异,染色体）-早鸽网

棉花pmc单染色体分离及其特异分子标记建立的方法

专利名称

棉花pmc单染色体分离及其特异分子标记建立的方法
发明者

刘方, 张香娣, 彭仁海, 王为, 王坤波, 王春英, 王玉红, 袁有禄, 黎绍惠
公开日

2012年7月4日
申请日期

2012年1月31日
优先权日

2012年1月31日
申请人

中国农业科学院棉花研究所
文档编号

C12N15/11GK102533733SQ20121002104
关键字

pmc 特异染色体棉花分离
权利要求

1.棉花花粉母细胞单染色体分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)取材、鉴定A.制作减数分裂中期染色体膜载片，切割与膜片内框大小相近的玻璃载片，将膜载片粘贴在完整的玻璃载片适当位置，再将膜载片反扣在支架上，所述膜片的材料为PET膜载片；B.取材，所用材料为棉花单体材料，取少许花药于玻璃载片，滴加卡宝品红染色，捣碎，除余渣，加盖片压片，压片完成后，镜检，在显微镜下直接观察，识别出有单个细胞且整体呈红色，外周有半透明状边圈的花蕾选用；C.预处理采用改良卡诺II，其配方为乙醇冰乙酸氯仿=5 3 2作为固定剂，室温下处理4h，其中固定液为样品的5倍以上，固定后用70%乙醇4°C保存，(2)显微切割目标染色体水洗预处理后的花蕾、低渗、酶解，将花药点在半片盖玻片上，加卡宝溶液并用镊子夹碎染色，将半片盖玻片反扣在垫有支架的膜载片上，轻轻按压，-20°C存放，取出有凝结水时快速揭片，去掉支架，干燥，进行显微切割，并收集目标染色体2.建立棉花单染色体特异分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)取材、鉴定A.制作减数分裂中期染色体膜载片，切割与膜片内框大小相近的玻璃载片，将膜载片粘贴在完整的玻璃载片适当位置，再将膜载片反扣在支架上，所述膜片的材料为PET膜载片；B.取材，所用材料为棉花单体材料，取少许花药于玻璃载片，滴加卡宝品红染色，捣碎，除余渣，加盖片压片，压片完成后，镜检，在显微镜下直接观察，识别出有单个细胞且整体呈红色，外周有半透明状边圈的花蕾选用；C.预处理采用改良卡诺II，其配方为乙醇冰乙酸氯仿=5 3 2作为固定剂，室温下处理4h，其中固定液为样品的5倍以上，固定后用70%乙醇4°C保存，(2)显微切割体系构建水洗预处理后的花蕾、低渗、酶解，将花药点在半片盖玻片上，加卡宝溶液并用镊子夹碎染色，将半片盖玻片反扣在垫有支架的膜载片上，轻轻按压，-20°C存放，取出有凝结水时快速揭片，去掉支架，干燥，进行显微切割，并收集目标染色体，(3)以步骤(2)分离的单染色体为材料，构建DNA文库、克隆随机测序后，利用标记软件开发分子标记，并将其定位在棉花特定染色体上
技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体地，涉及棉花PMC单染色体分离及其特异分子标记建立的方法
背景技术

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权力要求
说明书
法律状态

专利名称：棉花pmc单染色体分离及其特异分子标记建立的方法棉花分子标记广泛用于遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位、比较基因组学、起源进化等研究，同时广泛应用于分子标记辅助选择、品种设计、转基因育种等分子育种中，经过第一代RFLP、第二代SSR、第三代SNP为代表的发展历程，而其中第二代SSR分子标记由于共显性、重复性好、多态性高、操作相对简单等优点被广泛利用。SSR有gSSR(来自基因组序列)和eSSR(来自EST序列)两种。目前棉花遗传图谱(海陆种间)虽然说已经比较饱和(< 2cM)，但实际上远远不能满足实际要求，IcM可能要棉花覆盖基因组400-600Kb，所以有必要不断加密图谱。通过各种基因组文库或EST测序序列开发SSR标记是一个方法，但这只能覆盖整个基因组，无法达到定向、特异开发某条染色体分子标记的目的(例如1号染色体在比较饱和的图谱上也只有66个标记，而比它小的好多染色体上标记多于此，所以有必要对1号染色体进行定向加密)。中国专利申请CN20091008330 公开了一种棉花单染色体的分离方法，然而该方法仅能分离棉花体细胞的单染色体。体细胞和花粉母细胞的切割方法操作方法差异如下，故不能通用。本发明涉及分子标记领域，具体地，涉及棉花PMC单染色体分离及其特异分子标记建立的方法。根据本发明的方法包括取材、鉴定、显微切割目标染色体等步骤，并以分离的单染色体为材料，构建DNA文库、克隆随机测序后，利用标记软件开发分子标记，并将其定位在棉花特定染色体上。本发明的PMC切割方法只要有对应的单体材料即可，目前棉花26条染色体大部分都有；PMC切割更精确，假阳性低，但同时技术难度大，中期细胞少，目标染色体数量少，一个细胞只有一条。

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