一种以水稻秸秆为主要原料固态发酵产纤维素酶的方法【技术领域】[0001]本发明提供了一种以水稻秸杆为主要原料固态发酵制备纤维素酶的方法，采用的发酵菌株是2012年6月5日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为:CCTCC M2012204的木酶属里氏木酶Trichodema reesei QZ-5菌株，该发明的特点是以农产品废弃物-水稻秸杆为主要原料固态发酵制备纤维素酶，采用国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定酶活，即滤纸酶活力FPA测定，并换算成每克水稻秸杆可产纤维素酶的活力达4IU/g以上，所产纤维素酶可广泛应用于能源、纺织、造纸、饲料、食品等领域，属于生物[0002]纤维素酶是一类能够降解纤维素成葡萄糖的多组分复合酶系，可广泛应用于能源、纺织、造纸、饲料、食品等领域，近年来，随着全球资源能源短缺问题日显突出，纤维素酶是将自然界中分布最广、含量最多、最为廉价的纤维素作为再生资源的主要酶之一，从而使生产制备纤维素酶的研究成了全球科研工作者更关注的课题。[0003]然，现有纤维素酶制备的研究表明，纤维素酶的制备成本偏高，由于纤维素酶属于诱导酶类，纯纤维素通常被认为是纤维素酶合成的最佳诱导物，但纯纤维素价格昂贵，而农村水稻秸杆来源广泛，是农产品废弃物，本身既是纤维素又能作为微生物生长的碳源，这促使我们去探索研究变废为宝、低成本制备纤维素酶的方法，本发明就是在这样的指导思想下，经过无数次的试验获得成功的。
[0004]本发明提供了一种以`水稻秸杆为主要原料固态发酵制备纤维素酶的方法，采用的发酵菌株是2012年6月5日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为:CCTCC M2012204的木酶属里氏木酶Trichodema reesei QZ-5菌株，该发明的特点是以农产品废弃物-水稻秸杆为主要原料固态发酵产制备纤维素酶，采用国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定酶活，即滤纸酶活力FPA测定，并换算成每克水稻秸杆可产纤维素酶的活力达4IU/g以上，所产纤维素酶可广泛应用于能源、纺织、造纸、饲料、食品等领域，属于生物[0005]本发明的技术方案:2012年6月5日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为:CCTCC M 2012204的木酶属里氏木酶Trichodema reeseiQZ_5菌株为生产出发菌株，经种子培养和是以农产品废弃物-水稻秸杆为主要原料固态发酵生产制备纤维素酶，工艺为:[0006](I)种子培养基:葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L。[0007]200g/L马铃薯的制备:马铃薯去皮、切片后，取200g加1.5升水，煮沸20分钟，沙布过滤取滤液，定容到I升。[0008]接种工艺:取斜面菌种一支加入0.9%的生理盐水10ml，用竹签刮下培养基上的孢子，即为菌种孢子液，取Iml菌种孢子液放入含50ml种子培养基的250ml的三角中，置于摇床。培养条件:转速200rpm，温度28°C，恒温培养50小时，即为发酵产酶的种子液。
[0009](2)发酵产酶培养基
[0010]将水稻秸杆切成I厘米左右的小段，称20克放入500ml的三角瓶中，加入用醋酸和氢氧化钠调PH = 4.8的水50ml，121°C灭菌20分钟，冷却后待用。
[0011](3)发酵产酶及酶液提取
[0012]在灭菌冷却后的发酵产酶培养基中加入5ml种子培养液并充分混合，28°环境中静止培养9天，再加入200ml水，用棒充分搅散后，将250ml三角瓶置于温度为28。转速为200rpm的摇床上摇3小时，过滤得到酶液，用FPA测定法测酶活。
[0013](4)酶活的测定方法:
[0014]采用国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定酶活，即滤纸酶活力FPA测定。其定义为:在50°C，pH4.8的条件下，一个FPA国际单位等于酶水解反应中每分钟由滤纸生成1.0Uumol葡萄糖的酶量，以国际单位IU表示，滤纸酶活单位可以用体积表示IU/ml，其方法与步骤为:
[0015](I)将I X 6cm的滤纸条WhatmanN0.1滤纸条卷成圆筒,横放在IOmL比色皿试管底部，(不要垂直放下，不要使滤纸贴在试管壁上)。
[0016](2)向试管中加入Iml pH = 4.8的浓度为0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液。
[0017](3)将V体积的酶液加入到5mL的缓冲液中，适当的稀释。然后将0.5mL的酶稀释液加入到比色皿试管中。缓冲液作为空白。
[0018](4)将0.5mL酶液加入到装有ImL柠檬酸缓冲液的试管中
[0019](5)恒温水浴(500C )，反应I小时.[0020](6)加入ImLDNS试剂，沸水浴5min，冷水浴至室温，并定容到10mL。
[0021](7)540hm 下，测试 0D。
[0022](8)参照DNS的标准曲线，确定还原糖的含量。由(3)得到M毫克，由(4)得到m毫克。
[0023](9)公式如下: