专利名称：一种芹菜est-ssr指纹图谱构建方法及其应用的制作方法芹菜，属伞形科植物。有水芹、旱芹两种，功能相近，药用以旱芹为佳。旱芹香气较浓，又名“香芹"，亦称"药芹"。芹菜含有丰富蛋白质、胡萝卜素、碳水化合物、脂肪、B族维生素、维生素C、糖类、氨基酸及矿物质和膳食纤，其中磷和钙的含量较高。芹菜是高纤维食物，它经肠内消化作用产生一种木质素或肠内脂的物质，这类物质是一种抗氧化剂，常吃芹菜，尤其是吃芹菜叶，对预防高血压、动脉硬化等都十分有益，并有辅助治疗作用。芹菜是一年或两年生草本植物，株高约50 80厘米。茎一般都在手指粗细，中间 为空。根呈须状。叶为羽状复叶卵形。花白色。芹菜每年六月开始播种，一星期左右就可出苗，经过六十天左右生长，就可以食用。芹菜的开花期为七月至十一月，花朵细小呈白色，里面可找到种子。芹菜耐寒不喜高温，最佳温度在15到20摄氏度之间为佳。芹菜品种间形态特征差异极小，从植物学上较难区分，且易受到环境和人为因素影响；再加上芹菜为二年生蔬菜，生长期长，进行芹菜优良性状早期鉴定和遗传关系研究十分必要。通过分子标记对芹菜进行早期选择、预测，将会大大加速育种进程，缩短育种年限，同时某些不易区分的性状也将通过遗传标记的间接选择达到目的。利用遗传图，把优良基因，如雄性不育基因、抗病基因等分离出来都将会为芹菜遗传育种增加更为丰富的品系。和其它类型分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前遗传多样性和群体遗传结构研究中最常用的标记之一。目前开发的SSR标记主要有基因组SSR和EST-SSR两类。基因组SSR引物的开发通常需要构建基因组文库，花费大，效率低。随着大量表达序列标签(EST)的出现，对于许多植物而言，利用EST数据库开发SSR引物是一项高效、低花费的选择。另外，由于部分EST-SSR标记来自于基因的编码区，所以更容易获得基因表达的信息，可为功能基因的直接鉴定提供重要依据。目前EST-SSR 标记已被用于小麦(Eujayletal.，2001)、玉米(Wang and Bowen,1998)、大麦(Kota et al. , 2001; Thiel et al. , 2003)、甘鹿(Cordeiro et al. , 2001)、葡萄(Scott et al. , 2001)等的遗传作图(Kota et al. , 2001)、遗传多样性(Eujayl etal. , 2001)、基因发掘(Remington et al. , 2001; Vigouroux et al. , 2002)等研究。但关于标记芹菜EST-SSR指纹图谱的构建尚未见文献报道。
本发明的目的在于公开了一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用，为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下 一种芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于包括候选EST-SSR位点搜寻、验证、EST-SSR位点分析及指纹图谱构建步骤(1)候选EST-SSR位点搜寻以芹菜英文名或拉丁文名或别称为关键词查询GenBank数据库公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3 vl. O在线软件扫描分析EST序列中候选EST-SSR位点信息，并设计每个候选EST-SSR位点PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物； (2)候选EST-SSR位点验证以芹菜基因组DNA为模板，每个位点经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点； 其中的PCR扩增反应的总体积为10 UL，扩增反应体系为2XGoTaq Master Mixes 5uL,10u mol/L上游和下游引物各0. 25 ii L ；50 ng/ u L的芹菜基因组DNA模板I y L，双蒸水补足10 U L ;PCR反应程序为95°C预变性5 min，35个扩增循环(94°C 30 sec, 50°C 30sec, 72°C 30 sec) ;72°C延伸 7 min，4°C保存； 其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为浓度为8%，凝胶组分为去离子水21 mL, 10XTBE3 mL，40% PAG(聚丙烯酰胺)6 mL，TEMED(N，N，N，，N，-四甲基乙二胺)30 u L, 10%过硫酸铵300 u L ;设定电压250V，电泳lh，关闭电源，进行染色；染色过程固定液中浸泡5_10min， 硝酸银染色液银染8 10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一 EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点； (3)EST-SSR位点分析及指纹图谱构建将电泳图片导入GeneTools (Sygene)软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作X或者1，不条带处不记录或者记作O0采用本发明所述的构建方法构建芹菜EST-SSR指纹图谱，其特征在于包括8个EST-SSR位点信息、PCR扩增引物、11个芹菜育种材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱和基于EXCEL格式的指纹图谱
(1)8个芹菜EST-SSR位点及其PCR扩增引物


本发明公开了一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法以及指纹图谱的应用。该方法以芹菜育种材料的基因组DNA模板为研究对象，通过查询GenBank数据库上公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3v1.0在线引物设计软件，设计EST-SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出多态性较强的EST-SSR位点，并使用GeneTools(Sygene)软件进行条带分子量分析，构建EST-SSR指纹图谱。利用EST-SSR指纹图谱可用于芹菜品种亲缘关系、品种鉴定等分析。