虫草属真菌指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法【技术领域】。[0002]虫草属(Cordycep s)属于真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科。本属真菌绝大多数能感染昆虫，并从其头部或体表长出子座体而构成虫、菌复合体一虫草。当前虫草属真菌的应用形式主要有三种:ー种是原生态的虫草复合体(根据中国药典和中国真菌志的定义，虫草复合体由子座和菌核组成。菌核指长满菌丝的虫体，而子座是指在菌核上长出的“草”)，第二种是人工培养基栽培的子实体(即虫草无性型在人工培养基上栽培得到的“草”，以下简称子实体)，第三种是发酵菌丝体(即虫草无性型繁殖体)。目前，对虫草属真菌及其产品的鉴定评价，主要是采用高效液相色谱法測定其腺苷的含量，不低于0.01% (中国药典，2005版一部75页)。指标单一而不具特异性，再加上虫草属真菌的有效成分种类繁多，仅以腺苷作为虫草质控指标，无法客观反映虫草属真菌的质量，更不能对虫草属真菌进行鉴别。中药指纹图谱能基本反映中药全貌，使其质控指标由原有的对单ー成分含量的測定上升为对整个中药内在品质的检测，实现对中药内在质量的综合评价和整体物质的全面控制。但当前的文献集中于人工蛹虫草和冬虫夏草的指纹图谱的研究，所采用品种单一，产品形式没有区分，所采用方法不统一，造成结果没有可比性及其可评价性。所报道的也是单一品种的图谱(栾兰等，2010 ;于荣敏等2007，张红霞，2009)，缺乏品种之间的成分对比和含量分析。无法针对当前种类繁多、形式多祥的虫草属真菌及其产品的质量进行有效的评价。鉴于此，建立ー种涵盖多种虫草属真菌及不同形式虫草属真菌的鉴别评价方法对虫草属真菌进行进行全面准确的判定，具有重要的实际意义。目前，已有研究者在中药质量控制中提出这一概念(Xin-miao Liang, et al.Journal of ChromatographyA.2009,1216:2033~2044)，还有专利:ー种中药丹參的鉴别方法等。为解决虫草属真菌的鉴别评价与质控问题， 申请人:对 目前用于市场的虫草属真菌品种进行了不同产品形式的虫草属真菌产品进行指纹图谱研究，并建立标准方法。目前已经开发应用的虫草属真菌主要有6种，并且也是全部可以回接寄主验证其无性型的真菌，其基本生物学特征和遗传特性如下:[0003]冬虫夏草(Cordyceps sinensis)为虫草属，无性型为中华被毛孢(Hirsutellasinensis)，是最具药用价值的虫草菌，但资源稀缺，是当前消费者追逐的热点产品。其基因序列:CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCCTTATCGAGTCACCACTCCCAAACCCCCTGCGAACACCACAGCAGTTGCCTCGGCGGGACCGCCGGCGCCCCAGGGCCCGACCAGGGCGCCCGCCGGAGGACCCCCAGACCCTCCTGTCGCAGTGGCATTTNNCAGTCAAGAAGCAAGCAAATGAATC。[0004]蛹虫草(Cordyceps militaris)为虫草属，无性型为蛹拟青霉(Paecilomycesmilitaris)。蛹虫草富含的虫草素具有独特药理作用，是冬虫夏草的主要代替品，当前市场上大多数虫草产品是以蛹虫草为原料的。其基因序列:ACCCTTTGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCAGCGCCTGGACGCGGGCCTGGGCGGCGGCCGTCGGGGGCCCCAAACACTGTATCTACCAGTTTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACGTCCCCTGGGGGATGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGCCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTACCCCAACTCGCACCGGGAACCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACGCCCAACTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAA。[0005]球抱虫草(Cordyceps bassiana)为虫草属，无性型为球抱白僵菌(Beauveriabassiana)。与传统中药僵蚕在化学成分和药用功效上相似，具有潜在药用价值。其基因序列:TATTCGAGGTCACGTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGTCGGGGTTCCGGTGCGAGCTGTATTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCTGGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACAGAAGGGTTGGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTTACTTCCCA。[0006]高雄山虫草(Cordyceps takaomontana)为虫草属，无性型为日本拟青霉(Paecilomyces japonica)。韩国和日本对高雄山虫草研究较多，并将其作为冬虫夏草的替代物进行了开发利用。其基因序列:TGGGGTGTCTACCTGATCCGAGGTCACGITCAGAGGITGGGGGITTCACGGCGGGCCGCGTCGGGTTCCCGGTGCGAGTGCTTGTACTGCGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGGGTGCTGCCGGTCCCCAAGGCCGACGTCCCGGGGGACGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCGTTTGTGTTGCCTTGCGGCGGATTCAGAGAGGCTGACAGATACAGGGTTGCGTGGTCCCCGGCGGCCGCCTGGGTCCAGGTCGCGGGCCGGCGCTGGGCCGTCCGGACG`CTGGGGCGGGTCCGCCGAAGCAACTATGGGTAGGTTCACAGAAGGGTTGGGAGTTGTAAAACTCTGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTTACTTCCo
[0007]虫花(Isaria farinose)为虫草属，无性型为粉质拟青霉(Paecilomycesfarinosus)，是虫草中较为特殊的ー类，也归为棒束孢属(Isaria)。其基因序列:TGTGGGGCATTCTACTGATCCGAGGTCAACGTTCAGAAGTCGGGGGTTTTACGGCGTGGCCACGTCGGGGTTCCGGTGCGAGTTGGATTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTTCATTTCGGGGCCGGCGGTATACGGCCGGTCCCCAACGCCGATTTCCCCAAAGGGAAGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTGTTGCCTTGCGGCGGATTCAGAAGATACTGAGAATACAGAGTTTGGGGGTCTCCGGCGGCCGCCTGGATCCAGGCCGCGGCCGGCGCGGGGCCGGCCGGACGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTATGTTCACAGAAGGGTTTGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTTACTTCCA。
[0008]古尼虫草(Cordyceps gunnii)属虫草属，无性型为古尼拟青霉(Paecilomycesgunnii)，是继冬虫夏草后又ー种重要的虫草资源。其外形与冬虫夏草较为相似，与其他虫草不同的是其在镇痛、促进睡眠和记忆カ等方面具有良好的活性。其基因序列:CATTACCGAGTTTTCTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACTTATACCTATACTGTTGCTTCGGCGGGTCTTTGCCCCGGGGACGGACAGGGAGCCGGCAACGGCCCCCCTGGAAACCCCCCGGAACCAGGCGCTCGCCGGGGAACTCAAACTCTGTATTTCTCTTTACTGTATTGTATACCGTCTGAGTGACAAAAAACAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTACTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCACCCCCCGCTGCGGCTGTGGCGGGCGGGAGCCTGGTGTTGGGGACCGGCGGAAAACCTGCCCCCAGGGCAGCCGCCGCCCCCTAAATGAATTGGCGGCCTCGTCGCGGCCCTCCTCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCAACGGGAGCCCGGCGGCGGCCACTGCCGTAAAACGCACAATCTTCTCTTCTAGAGTTGA。


[0009]本发明对虫草属真菌的6个验证无性型的虫草为研究对象，又依据每种虫草属真菌在应用方面有不同的产品形式，选取不同虫草属真菌的子座、菌丝体和子实体为材料，采用用高效液相色谱(HPLC)方法，提供了三种应用形式的虫草属真菌的标准指纹图谱；建立起标准指纹图谱及指纹图谱中共有化合物含量的測定方法和虫草属真菌及不同产品形式的鉴别评价体系，可用于虫草属真菌质控及真伪鉴别。
[0010]本发明的优点如下:
[0011](I)本发明中建立了子座、菌丝体、子实体三种形式虫草属真菌的标准指纹图谱，与其他指纹图谱一祥都能反映药材化学成分的整体面貌特征。同时设定了共有特征成分的定量评价指标。该法结合了现有虫草属真菌鉴定评价方法一指纹图谱分析法和特定成分定量分析法的优点，避免了只测单一成分判定虫草整体质量的片面性，又降低了以次充好、以假乱真等造假行为的可能性。
[0012](2)本发明提供了ー套全面、系统、准确、可靠的虫草属真菌质量评价体系，同时为虫草属真菌的鉴别提供了一种新的方法。为虫草属真菌资源的合理开发利用提供检测技术支持。
[0013](3)本发明具有简便快捷、稳定性好、精密度高、重现性好等特点。益于推广应用。也为虫草属真菌产品的标准制定提供了可靠方法。



[0014]图1虫草属真菌子座标准指纹图谱
[0015]图2虫草属真菌菌丝体标准指纹图谱
[0016]图3虫草属真菌子实体标准指纹图谱
[0017]图4对照品图谱

[0018]1.虫草属真菌HPLC标准指纹图谱的建立方法
[0019]1.1仪器与试剂
[0020]1.1.1 仪器
[0021]Waters 2690型HPLC高效液相色谱仪；光电二极管阵列检测器；Waters色谱工作站。
[0022]1.1.2材料试剂
[0023]冬虫夏草(Cordycepssinensis)、蛹虫草(Cordyceps militaris)、球抱虫草(Cordyceps bassiana)、闻雄山虫草(Cordyceps takaomon tana)、古尼虫卓(Cordycepsgunnii)、虫花(Isaria farinose)的子座、菌丝体和子实体等虫草材料，
[0024]标准对照品:虫草素、腺苷、尿苷、鸟苷、肌苷、胞苷、胸苷，均购自Sigma公司；甲醇，色谱纯。
[0025]1.2色谱条件
[0026]色谱柱:AgilentZorbax Extend C18 (250mm X 4.6mm, 5 U m)分析柱；进样量:IOuL ;流速:0.5mL/min ;柱温:25°C;检测时间:40min ;检测波长:260nm。流动相擦采用甲醇(A)-水(B)系统，甲醇浓度在5% -75%范围进行梯度洗脱。
[0027]1.3指纹图谱测定
[0028]虫草属真菌供试样品液制备:精密称取粉末(过80目筛)样品1.00g，置于具塞容器中，加入超纯水50mL，振荡IOmin使粉末完全浸透，超声提取20min，6000r/min离心IOmin,取其上清液用0.22 ii m的微孔滤膜过滤，滤液作为供试样品溶液。
[0029]吸取10 ii L注入高效液相色谱仪进行測定，记录40min内的色谱图。在此条件下分析供试样品液，得到样品的指纹图谱。
[0030]1.4标准指纹图谱的`确立
[0031]按照上述方法，分别对六种虫草属真菌的子座、菌丝体、子实体分别建立HPLC指纹图谱。经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》确立共有特征峰，并拟合建立虫草属真菌的子座、菌丝体、子实体的标准指纹图谱。虫草属真菌子座标准指纹图谱(见图1)，确立了 6个共有特征峰，其平均相对保留时间及其相对标准偏差统计结果(见表1)。虫草属真菌菌丝体标准指纹图谱(见图2)，确立了 11个共有特征峰，其平均相对保留时间及其相对标准偏差统计结果(见表2)。虫草属真菌子实体标准指纹图谱(见图3)，确立了 10个共有特征峰，其平均相对保留时间及其相对标准偏差统计结果(见表3)。
[0032]1.5指纹图谱精密度试验
[0033]按照指纹图谱精密度测试规定方法操作，随机抽取一份供试品，连续进样6次，分别对主要色谱峰的相对保留时间及其峰面积进行统计。相对保留时间RSD%低于1.0%，峰面积RSD%低于2.5%0
[0034]1.6指纹图谱重现性试验
[0035]随机抽取一种供试品，制取6份供试样品液进样，分别对主要色谱峰的相对保留时间及其峰面积进行统计。相对保留时间RSD%低于1.0%，峰面积RSD%低于3.0%，。
[0036]1.7指纹图谱稳定性试验
[0037]随机抽取一份供试品进样，考察供试样品液与仪器在24h内的稳定性。计算主要色谱峰的相对保留时间和峰面积的相对标准偏差。相对保留时间RSD%低于1.0%，峰面积RSD%低于 3.0%0
[0038]该测定方法精密、稳定、重现性好，满足中药色谱指纹的技术要求。
[0039]表1虫草子座标准指纹图谱共有特征峰
[0040]