专利名称：采用复合est-ssr标记进行大白菜品种鉴定的方法随着植物育种和种子产业的发展，植物新品种保护(Protection of New Varieties of Plant，简称PVP)作为知识产权的10种内容之一，其重要性越来越突出。培育和推广新的优良品种是我国蔬菜育种发展的重要方向，因此新品种的准确鉴定不仅是新品种审定和保护的前提，也为辨别假冒伪劣种子，保护自身知识产权，维护育种家的切身利益提供保障和科学依据。因此，开发高效、准确的种子品种鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。大白菜是原产于我国并广受欢迎的蔬菜，栽培面积极广，品种的差异直接影响这类蔬菜的生产和使用性能，因此对商用种子品种的鉴别尤为重要，同时新品种的登记测试以及资源种质遗传性分析都需要有别于传统的形态标记田间检测的更加高效、准确、低成本以及操作方便的分子水平品种鉴定方法。近年来随着分子生物学的发展，各种分子标记技术在杂交种品种鉴定中得到了大量应用。遗传标记经过形态标记、细胞学标记、蛋白质标记发展到DNA标记。DNA标记是DNA 水平上遗传多态性的直接反映，表现为核苷酸序列上的差异，因此标记在数量上几乎是无限的。与以往遗传标记相比，DNA标记还具有无表型效应，不受环境影响等优点，广泛应用到种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等方面，成为理想的快速进行种子品种鉴定的检测方法之一，其中RAPD、RFLP、AFLP、SSR及ISSR标记等在杂交种品种鉴定中都有应用。简单重复序列(Simplesequence repeat, SSR)也叫微卫星(Microsatellites )。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态信息含量闻、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，已被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。根据建立SSR标记的序列性质不同，SSR标记可分为基因组SSR ( Genomic SSR，gSSR)和表达序列标签SSR (Expressed sequence tag SSR, EST-SSR)等。常规SSR分子标记开发需要构建基因组文库、制备探针和分子杂交等过程，极大地制约了其发展和应用。随着功能基因组学的迅速发展，Gen Bank中积累了许多重要物种的大量EST (expressed sequence tag)序列，这些序列已经成为发展SSR标记(EST-SSR) 的重要来源。与来自基因组中SSR标记相比，不仅具有基因组SSR标记的多态性高、共显性、重复性好的特点，而且开发成本相对低廉。同时EST-SSR标记位于基因的转录部分，因而与功能基因紧密连锁。目前EST-SSR标记已经应用于水稻(Cho et a7.，2000)、葡萄( Scott et al. , 2000 )、小麦(Gupta et al. , 2003 ；Gao et al. , 2004 ； Nicot et al. , 2004 )、黑麦(Hackauf et a入，2002)、大麦(Thiel et a7. ,2003)和扁桃(Xu et a7. ,2004) 、玉米(Wang and Bowen, 1998)、甘鹿(Cordeiro et al. , 2001)等植物进行分子连锁图谱构建和遗传多样性分析。
本发明的目的在于在分子标记最新研究成果的基础上，发展EST-SSR多重标记组合及其检测技术，扩大SSR标记的多态信息量，弥补其位点少的缺陷，一次扩增反应可以得到多个多态标记同时对大白菜多个品种进行鉴别。公开了一种采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案用于大白菜品种鉴定的EST-SSR引物，其特征在于，包括I套或II套EST-SSR复合引物，其中的I套EST-SSR复合引物包括BCl 上游引物序列5’ - TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3，，BCl 下游引物序列5’ -CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3，；BC19 上游引物序列5’ - TTGAAACTTGGTTGACGACG -3’， BC19 下游引物序列5’ - TTCTTCTTTGCGGCTGATTT -3，；BC26 上游引物序列5’ -ATAACAACAACCTGCCCGAG _3’，BC26 下游引物序列5’ - GAAGCACAAGAACAGGGCTC -3’ ；II套EST-SSR复合引物，包括BCl上游引物序列5’ - TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3，，BCl 下游引物序列5’ - CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3，；BC9 上游引物序列5’ -ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT -3’，BC9 下游引物序列5’ - TTTTGAACGAGGTGGAGGAC -3’ ； BClO 上游引物序列5’ - GAATCCTTTGGAAACGACGA _3’，BClO 下游引物序列:5’ -GGGGACACAATTCTCCTGAA -3’ ；BC16 上游引物序列5’ - CTTGCAAATGACCTGCTTGA -3’， BC16 下游引物序列5’ - GGGAGTTGGAGATGAGGTGA -3’ ；BC27 上游引物序列5’ -ATCCAAAAGGAAGAATCCCG _3’，BC27 下游引物序列5’ - AAACGAGAATTTTCCTGCGA -3’ 。本发明进一步公开了采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法，其特征在于按如下步骤的步骤进行(O采用权利要求I所述的复合EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μ L，扩增反应体系为2XGoTaq Master Mixes 5 μ L，上游和下游引物10 μ mo I/L各O. 25 μ L，供试品种大白菜杂交种基因组DNA模板，浓度 50 ng/yL，lyL，双蒸水补足10 μ L ;PCR反应程序为94°C预变性5 min，35个扩增循环 (940C I min,53. 5°C 45 sec, 72°C 45 sec) ;72°C延伸 7 min，4°C保存；
(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为去离子水 21mL，10XTBE 3 mL,40% PAG 6 mL, TMED 30 μ L，10% 过流酰胺 300 μ L ;设定电压250 V，电泳I h，关闭电源，进行染色；染色过程银染8 10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(3)通过分析EST-SSR结果，比较12份大白菜品种间多态性位点的差异，确定2套复合引物的多态率及多态信息量；在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建12份大白菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析复合引物是否可对12份大白菜品种进行完全的区分， 同时构建12份大白菜品种的指纹图谱；
其中所述的上游和下游引物lOymol/L各O. 25yL，指的是I套EST-SSR复合引物中BCl上游引物O. 25 μ L、BCl下游引物O. 25 μ L，BC19上游引物O. 25 μ L、BC19下游引物 O. 25μ L，BC26上游引物O. 25μ L、BC26下游引物O. 25 μ L，或II套EST-SSR复合引物中BCl上游引物0. 25 u L、BCl下游引物0. 25 u L，BC9上游引物0. 25 u L、BC9下游引物0. 25 u L， BClO上游引物0. 25 u L, BClO下游引物0. 25 u L, BC16上游引物0. 25 u L, BC16下游引物 0. 25 u L, BC27上游引物0. 25 u L、BC27下游引物0. 25 Uし本方法通过对12份供试大白菜杂交种进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析， 确认了这套技术和组合可以表达大白菜品种间的多态性，能够高效准确的对大白菜品种进行鉴定。用于对大白菜品种进行鉴定的2套复合EST-SSR引物组合如表I所示。表I引物序列表如下


本发明公开了一种采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法。该方法以12份大白菜杂交种的基因组DNA为模板，通过对大白菜EST序列的分析，合成了30对核心EST-SSR引物。经过筛选，得到2套标记组合完全鉴别了12份大白菜品种的差异，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，确认了这套技术和组合可以表达大白菜品种间的多态性，能够高效准确的对大白菜品种进行鉴定。本发明的检测方法在4h之内即可完成种子品种鉴定工作，具有高效、准确、低成本、操作方便等优势。可以有效的对大白菜种子真伪进行监控，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供了有力的技术手段。