用于植物的ssr标志物及其用途【【 [0002]麻风树(Jatropha curcas)(大戟科(Euphorbiaceae)),也被称为珊瑚树，是非-食品作物含油-种子树(或大灌木)，其可生长达5m。麻风树(J.curcas)似乎原产于中美洲或南美洲。其现在跨热带和亚热带生长，诸如在非洲和亚洲。天然地，其是由昆虫交叉授粉的，但也可通过插枝生长。麻风树(J.curcas)从未为产率广泛地栽培。[0003]遗传多样性的程度是作物改良程序的前提。在麻风树(J.curcas)中，遗传多样性的形态学表征可由于环境甚至对高度可遗传的种子特性诸如平均种子重量、种子蛋白和油含量的强影响而产生偏差。因此，通过使用中性分子标志物(不受环境影响)产生的遗传信息是必要的，由于其是更可靠的和一致的。关于自不同地点的麻风树(J.curcas)种群的来源和遗传多样性的信息少。由此，种质的遗传多样性的鉴定会对于鉴定适合于遗传改良(育种程序)和遗传作图的亲本品系是有用的。[0004]简单序列重复(SSR，也被称为SSR或微卫星)是2~6个碱基长度(数目有所不同)的短核苷酸序列的串联重复。SSR可由聚合酶链反应(PCR)用2个或更多特异性引物扩增。在扩增之后，产生不同长度的PCR产物，表示等位基因多态性。当引物结合位点之内有突变时也出现无扩增的无效等位基因。[0005]SSR对于评定遗传多样性有用(Ashley等人.2003)。SSR标志物是优选的，因为它们常常在多数真核生物中是等显性的、高度可再现的和频繁的，并揭示高等位基因多样性(Mohan等人，1997)。但是，根据由Sun等人，2008的研究，在56个在册中国麻风树(J.curcas)之中使用由FIASCO (由含重复序列的AFLP的快速分离)流程开发的17种SSR引物未检测到多态性。但是，在相同的论文中报道，在在册中国麻风树(J.curcas)中，仅AFLP标志物显示多态性。[0006]由此，需要提供为基因分型目的，种系发生和也为遗传和连锁图，用于筛选种群的麻风树(J.curcas)遗传分析新工具。[0007]【发明概述】[0008]本发明涉及SSR标志物和用于扩增SSR标志物的引物。扩增的SSR标志物大小有所不同，且是多态等位基因。本发明的SSR标志物可用于分子基因分型和/或遗传指纹法。
[0009]根据第I方面，本发明提供测定植物样品的基因型的方法，包括:
[0010](i)提供来自样品的DNA;
[0011](ii)用选自下列的至少一个引物对扩增至少一种多态SSR标志物:SEQ ID NO:1和 2;SEQ ID N0:3 和 4;SEQ ID N0:5 和 6;SEQ ID N0:7 和 8;SEQ ID NO:9 和 10 ；SEQ IDNO:10P12;SEQ ID N0:13和14;SEQ ID N0:15和16;SEQ ID NO: 17和 18 ;&SEQ ID NO: 19和20，或者各对的片段或变体；以及[0012](iii)鉴定存在于样品中的SSR标志物的至少一种多态等位基因。
[0013]可分离扩增产物，以鉴定存在的等位基因。或者，样品中SSR标志物的多态性可通过测序鉴定。
[0014]本发明也提供用于扩增至少一种SSR标志物的分离的寡核苷酸引物，选自:SEQ IDNO:1~20或其片段或变体。本发明还提供用于扩增至少SSR标志物的分离的寡核苷酸引物对，其选自:SEQ ID NO:1 和 2 ；SEQ ID NO: 3 和 4 ；SEQ ID NO: 5 和 6 ；SEQ ID NO: 7 和 8 ；SEQ ID NO:9 10 ；SEQ ID NO: 11 和 12 ；SEQ ID NO: 13 和 14 ；SEQ ID NO: 15 和 16 ；SEQ IDNO: 17和18以及19和20，或者各引物对的片段或变体。
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[0015]图1显示通过使用包含SEQ ID NO: 11和12的引物对扩增的8个麻风树(J.curcas )样品的电泳图谱。
[0016]图2显示通过使用包含SEQ ID NO: 11和12的引物对扩增的8个麻风树(J.curcas)样品的银染色的聚丙烯酰胺凝胶。
[0017]图3显示用10种SSR标志物基因分型的927个麻风树(J.curcas)样品的主成分分析(PCA)结果。
[0018]图4显示通过使用10种SSR标志物产生的K=3模拟的数据组的条形图结果，以对927个麻风树(J.curcas)样品进行基因分型。
[0019]图5显示对于来自STRUCTURE聚类分析的K的AK=m|L” (K) /S [L(K)]的标绘图。
[0020]【定义】
[0021]缩写“SSR”代表“简单序列重复”且指称以特定核苷酸序列重复至少一次的任何短序列。SSR可见于生物基因组的编码及非-编码区。术语SSR可与“微卫星”互换使用。SSR可由通式(N1N2….Ni) n表不,其中N表不核苷酸A、T、C或G, i表不碱基重复中的核苷酸数，及η表示以特定DNA序列碱基重复次数。碱基重复，即N1N^ Ni，也被称为“SSR基序”。重复SSR基序一般可为单-核苷酸、二-核苷酸、三核苷酸或四核苷酸基序。例如(ATC)4指称三-核苷酸。SSR是高度多态的，其中各SSR座位可具有许多“等位基因”形式。多态SSR座位是用于鉴定、亲子关系测试及遗传作图的任何生物中极其有用的标志物。多态性是SSR的特征，其贡献于它们在基因分型和/或遗传指纹法中的有用性。
[0022]“完全重复”指称无中断及无不同基序的相邻重复的重复的SSR基序。但是，当重复的SSR基序被许多非-重复的核苷酸间断时，重复可为“不完全的”，诸如在(AC) 5GCTAGT (AC) 7中。不完全重复也可视为重复序列，其中一些个体碱基突变。SSR的其他可能的变异为本领域技术人员所知。这些重复，包括复合重复，被Weber (1990)定义。
[0023]“复合重复”指称含有可被非-重复的核苷酸的延伸物隔开的至少2种不同重复的基序的SSR。复合重复的一例是(ATC)5(AT)615
[0024]“SSR座位”指称SSR标志物在染色体上的位置。座位可被SSR标志物的等位基因中的任何一种占据。“等位 基因”是占据染色体上的给定座位的SSR标志物的几种替代性的形式之一。
[0025]【发明详述】[0026]本发明的寡核苷酸引物和SSR标志物从麻风树(J.curcas)基因组数据得到。SSR标志物及分离的寡核苷酸引物可用于区别麻风树属(Jatropha)物种。尤其是，SSR标志物及分离的寡核苷酸引物可用于区别麻风树(J.curcas)与其他麻风树属(Jatropha)物种。
[0027]SSR标志物由寡核苷酸引物扩增。本发明的例示寡核苷酸引物包含以下表1中的序列。
[0028]表1的10个引物对中的每一个可用于扩增来自植物样品的SSR标志物。本发明的各寡核苷酸引物对和/或SSR标志物揭示麻风树(J.curcas)样品中的多态性。
[0029]表1:本发明的分离的寡核苷酸引物的例
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