具有高丝氨酸乙酰转移酶活性的修饰多肽和表达其的微生物的制作方法物[0001]1、发明领域[0002]本发明涉及被修饰以具有高丝氨酸乙酰转移酶活性的多肽、编码其的多核苷酸、包括该多核苷酸的重组载体、用该重组载体转化的微生物和利用该微生物生产O-乙酰高丝氨酸的方法。[0003]2、相关技术的描述 [0004]甲硫氨酸是体内的必需氨基酸之一，并已经广泛用作动物饲料和食品添加剂，以及医学水性溶液的成分和医药产品的其他原料。甲硫氨酸作为胆碱(卵磷脂)和肌酸的前体，并且也用作半胱氨酸和牛磺酸合成的原料。此外，它作为硫供体起作用。[0005]S-腺苷-甲硫氨酸源于L-甲硫氨酸并用作体内的甲基供体，并且它参与大脑中多种神经递质的合成。也发现甲硫氨酸和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)预防在肝脏和动脉中的脂质积累和有效治疗抑郁症、炎症、肝脏疾病和肌肉痛。[0006]甲硫氨酸可被化学或生物合成，以用于动物饲料、食品和药品。[0007]在化学合成中，L-甲硫氨酸主要由5-(β_甲基巯乙基)_乙内酰脲的水解生产。然而，化学合成的甲硫氨酸具有仅作为混合形式的L-型和D-型生产的缺点。
[0008]关于L-甲硫氨酸的生物合成，美国专利公布号US2005/0054060A1描述了以下方法:直接利用H2S或CH3SH,而不使用半胱氨酸，通过修饰用于微生物制备的胱硫醚合酶合成高半胱氨酸或甲硫氨酸。在该方法中，被修饰的胱硫醚合酶被直接引入细胞，以根据细胞内甲硫氨酸合成过程合成甲硫氨酸。然而，存在如下实际问题，其中因为由利用细胞内甲硫氨酸代谢途径合成的甲硫氨酸引起的抑制作用，该方法仅产生少量甲硫氨酸，并且H2S或CH3SH也引起细胞毒性。
[0009]为了解决这些问题，本发明人已经开发了通过酶反应将L-甲硫氨酸前体转变成L-甲硫氨酸的两步法(PCT/KR2007/003650)。该两步法可解决H2S或CH3SH的细胞毒性和产生的L-甲硫氨酸的代谢过程抑制的问题。此外，该方法的特征为选择性地仅生产L-甲硫氨酸，而不是混合形式的D-甲硫氨酸和L-甲硫氨酸非常有效。
[0010]在该两步法中，O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸可用作甲硫氨酸前体。在甲硫氨酸的转化反应期间，就前体与甲硫氨酸比率的生产率而言，O-乙酰高丝氨酸优于O-琥珀酰高丝氨酸。具体地，可从I摩尔的O-乙酰高丝氨酸生产0.91摩尔的甲硫氨酸，而可从I摩尔的O-琥珀酰高丝氨酸生产仅0.67摩尔的甲硫氨酸。因此，最终产物甲硫氨酸的生产成本可通过将O-乙酰高丝氨酸用作甲硫氨酸前体而降低，并且O-乙酰高丝氨酸的高生产率为甲硫氨酸大量生产的关键因素。
[0011]同时，将O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸作为甲硫氨酸前体的使用取决于微生物的类型。详细地，属于埃希氏菌(Escherichia)属、肠细菌(Enterobacteria)属、沙门氏菌(Salmonella)属和芽胞杆菌(Bacillus)属的微生物，通过L-高丝氨酸O-琥珀酰转移酶从高丝氨酸和琥拍酰-coA生产O-琥拍酰-高丝氨酸(Biochemistry.19990ct26; 38 (43): 14416-23),和属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、钩端螺旋体(Leptospira)属、奇异球菌(Deinococcus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属和分支杆菌(Mycobacterium)属的微生物通过L-高丝氨酸O-乙酰转移酶从高丝氨酸和乙酰辅酶A生产O-乙酰高丝氨酸(Journal of Bacteriology, Mar.2002，ρ.1277-1286)。
[0012]因此，利用用于为了实验和工业目的生产重组蛋白的埃希氏菌属的微生物，生物合成O-乙酰高丝氨酸，需要通过引入metx——种外源基因一表达O-乙酰高丝氨酸转移酶。然而，存在与消费者对于外源基因引入用于生产食品的微生物的否定态度和证明外源基因引入的安全性相关的问题。
[0013]因此，本发明人已经做出努力，以制备埃希氏菌属的菌株，所述菌株产生就生产率而言有利的O-乙酰高丝氨酸，而不引入外源基因。结果，他们发现通过使用由用谷氨酸替代在来自大肠杆菌的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的位置111处的氨基酸制备的修饰多肽，可将高丝氨酸琥珀酰转移酶活性转变成高丝氨酸乙酰转移酶活性，由此完成本发明。


[0014]本发明的目的是提供修饰多肽，其中具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的该多肽被转变为具有高丝氨酸乙酰转移酶活性。
[0015]本发明的另一个目的是提供编码以上修饰多肽的多核苷酸。
[0016]本发明的再一个目的是提供重组载体，其包括可操作地连接至以上多核苷酸的多核苷酸序列。
[0017]本发明的再一个目的是提供包括以上多核苷酸的微生物。
[0018]本发明的再一个目的是提供被可操作地连接至以上多核苷酸的重组载体转化的微生物。`
[0019]本发明的再一个目的是提供利用表达具有高丝氨酸乙酰转移酶活性的修饰多肽的微生物，生产O-乙酰高丝氨酸的方法。



[0020]图1是显示可操作地连接至编码根据本发明的修饰多肽的多核苷酸的重组载体的图；
[0021]图2显示了大肠杆菌变体之间的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的初级氨基酸序列的同源性比较；
[0022]图3和4显示了对甲硫氨酸的反馈调节有抗性的突变体高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的初级氨基酸序列的同源性比较，其中在PCT公布号W02008/127240中公开的野生型高丝氨酸O-琥珀酰转移酶、抗反馈调节的突变体高丝氨酸O-琥珀酰转移酶metlOA和metllA，和在PCT公布号W02005/108561中公开的抗反馈调节的突变体高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的初级氨基酸序列用于比较；和
[0023]图5为显示通过重叠PCR以便在染色体中用pro启动子替代acs启动子,制备FRT-—步缺失盒的图。
[0024]
[0025]在实现以上目的的一个方面中，本发明提供了具有高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的修饰多肽，所述修饰多肽具有SEQ ID N0.17或与其至少95%的同源性的氨基酸序列，其中自序列的起点氨基酸——甲硫氨酸——的位置111上的氨基酸，用谷氨酸替代。
[0026]如本文所用，具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽指具有从存在于甲硫氨酸生物合成途径的高丝氨酸和琥珀酰-coA合成O-琥珀酰高丝氨酸的活性的多肽，如以下反应方案显示。
[0027]高丝氨酸+琥珀酰-CoA->0-琥珀酰-高丝氨酸
[0028]具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽可为重组多肽，其来自肠细菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、芽胞杆菌属或埃希氏菌属的微生物，优选地，具有来自埃希氏菌属的微生物的高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的重组多肽，和更优选地，具有来自大肠杆菌的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的重组多肽。
[0029]在本发明中，具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽可包括具有高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的多肽，所述多肽由SEQ ID NO: 17或与其至少95%同源的氨基酸序列组成，只要它具有以上反应方案显示的活性。
[0030]在本发明的实例中，比较了在大肠杆菌不同种类之间的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的氨基酸序列的同源性。结果，在不同种类的大肠杆菌之间的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶多肽中具有小于5%的变异(即，它们具有至少95%的同源性)，但高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性没有显著差异(图2)。这些结果指示与本发明的SEQ ID NO: 17的多肽具有95%或更多同源性的多肽也具有相同的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性，其对本领域技术人员是显而易见的并由本发明人形象化。
[0031]如本文所用，不像野生型，术语“修饰多肽”表示通过替代具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽的一部分氨基酸序列而具有高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的多肽。即，本发明的修饰多肽指如在以下反应方案中具有相同活性的修饰多肽，其通过替代具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽的一部分氨基酸序列，具有对乙酰辅酶A而不是琥珀酰-C0A的底物特异性。
[0032]高丝氨酸+乙酰辅酶A->0-乙酰高丝氨酸
[0033]在本发明中，以上修饰多肽可为修饰多肽，其中在具有SEQ ID N0:17的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO: 1795%或更多的序列同源性的多肽的位置111处的氨基酸用谷氨酸(SEQ ID N0.:18)替代，和在多肽的位置112处的氨基酸进一步用苏氨酸(SEQ IDNO: 19)或组氨酸(SEQ ID NO:20)替代。
[0034]发现苏氨酸或组氨酸进一步替代位置112处的氨基酸亮氨酸增强了高丝氨酸乙酰转移酶活性(表2和3)。
[0035]根据一个优选的实施方式，以上修饰多肽可为具有SEQ ID NO: 18至20的氨基酸序列中的任一个的多肽。
[0036]在本发明的实施例中，制备了能够表达其中用谷氨酸替代高丝氨酸琥珀酰转移酶的位置111处的氨基酸甘氨酸——所述高丝氨酸琥珀酰转移酶由SEQ ID N0:39代表的核苷酸序列组成的大肠杆菌的metA基因编码一的多肽的质粒，和能够表达其中除了以上替代之外还用苏氨酸或组氨酸替代位于位置112处的氨基酸的多肽的质粒(实施例2)。
[0037]进一步地，本发明的实验实施例显示了仅O-琥珀酰高丝氨酸通过用包括野生型 metA 基因(SEQ ID NO:39)的质粒转化的 CJM2pCL_Pcjl_metA(wt)和 CJM3pCL_Pcjl_metA(wt)产生。相比之下，仅O-乙酰高丝氨酸由用包括编码本发明的修饰多肽的基因的质粒转化的菌株积累(实验实施例2，表2和3)。
[0038]因此，表达本发明的修饰多肽的微生物是有利的，因为它能够产生O-乙酰高丝氨酸作为能够高产量生产的甲硫氨酸前体，而无需为了高丝氨酸乙酰转移酶活性引入外源基因。
[0039]在本发明中，以上修饰多肽可对由替代具有高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的多肽的一部分氨基酸导致的甲硫氨酸的反馈调节有抗性。即，高丝氨酸琥珀酰转移酶的多数活性通过培养基中少量甲硫氨酸的反馈抑制调节，并且因此本发明的修饰多肽可对甲硫氨酸的反馈调节有抗性，用于O-乙酰高丝氨酸的大量生产。
[0040]在本发明中，避免甲硫氨酸的反馈调节的氨基酸替代可根据PCT公布号W02008/127240中公开的方法实施。详细地，甲硫氨酸的反馈调节可通过对具有高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的多肽进行下述替代而避免:脯氨酸对位置29处的氨基酸的替代、甘氨酸对位置114处的氨基酸的替代、丝氨酸对位置140处的氨基酸的替代或三种氨基酸替代的一种或多种的组合。优选地，可替代两种或更多种，和最优选地三种氨基酸。
[0041]根据一个优选的实施方式，对甲硫氨酸的反馈调节有抗性的修饰多肽可为具有选自SEQ ID NO:21至23的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列的修饰多肽。
[0042]在本发明的实施例中，由大肠杆菌的metA基因编码的具有高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的重组多肽的位置29、114和140处的氨基酸分别由脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸替代，以避免甲硫氨酸的反馈调节。另外，构建的是包括编码具有高丝氨酸乙酰转移酶活性的修饰多肽的多核苷酸的质粒，其为由谷氨酸对位置111处的氨基酸的替代制备的[pCL_Pcjl_metA#ll (EL)]，由谷氨酸和苏氨酸对位置111和112处的氨基酸的替代制备的[pCL_Pcjl_metA#ll (ET)]，和由谷氨酸和组氨酸对位置111和112处的氨基酸的替代制备的[pCL_Pcjl_metA#ll (EH)](实施例 3)。
[0043]进一步地，本发明的实`验实施例显示在表达对甲硫氨酸的反馈调节有抗性的修饰多肽的菌株中，由谷氨酸和组氨酸对在位置111和112处的氨基酸的替代制备的CJM2pCL_PcjljnetA (#11) EH 和 CJM3pCL_Pcjl_metA(#ll)Hl 菌株显示了分别为 11.lg/L 和 24.8g/L的高O-乙酰高丝氨酸生产力，和O-乙酰高丝氨酸的这些积累类似于通过引入外源高丝氨酸乙酰转移酶基因的那些(实验实施例2，表2和3)。
[0044]在另一方面，本发明提供了编码修饰多肽的多核苷酸或包括可操作地连接至该多核苷酸的多核苷酸序列的重组载体。
[0045]在本发明中，以上多核苷酸为由在链中共价连接的核苷酸单体组成的核苷酸多聚体，和其实例为具有预定或更长长度的DNA或RNA链，并且它为编码以上修饰多肽的多核苷酸。
[0046]在本发明中，以上多核苷酸可为具有SEQ ID N0:24至29的核苷酸序列中的任一个的多核苷酸。
[0047]如本文所用，以上术语“重组载体”是用于通过将DNA引入宿主细胞以便制备表达本发明的修饰多肽的微生物来表达修饰多肽的工具(means)，并且可使用已知的表达载体诸如质粒载体、黏粒载体和噬菌体载体。载体可由本领域技术人员根据利用重组DNA技术的任何已知方法容易地制备。[0048]在本发明中，重组载体可为pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322或pMW118载体，和优选地pCL1920载体。
[0049]术语“可操作地连接”表示表达调节序列以调节编码修饰多肽的多核苷酸序列的转录和翻译的方式进行连接，并包括以当多核苷酸序列在调节序列(包括启动子)的控制下进行表达时产生由多核苷酸序列编码的修饰多肽的方式保持精确的翻译框(translation frame)。
[0050]仍然在另一方面，本发明提供了包括编码以上修饰多肽的多核苷酸的微生物和用可操作地连接至编码以上修饰多肽的多核苷酸的重组载体转化的微生物。
[0051]如本文所用，术语“转化”表示将基因引入宿主细胞中以在宿主细胞中表达的方法。转化的基因，如果它处于在宿主细胞中表达的状态，则可被插入宿主细胞的染色体或可独立于染色体而存在。
[0052]另外，该基因包括作为能够编码多肽的多核苷酸的DNA和RNA。该基因可以以任何类型引入，只要它可以被引入宿主细胞并在其中表达。例如，该基因可以以表达盒的类型引入宿主细胞，所述表达盒为多核苷酸构建体，其包括独自表达基因的全部元件。通常，该表达盒包括启动子、转录终止信号、核糖体结合部位和翻译终止信号，其被可操作地连接至该基因。该表达盒可为能够自复制的表达载体的类型。以上基因也可被独自或以多核苷酸构建体的类型引入宿主细胞，以便被可操作地连接至在宿主细胞中表达所需要的序列。
[0053]以上微生物为原核或真核微生物，其能够通过包括编码修饰多肽的多核苷酸或通过利用可操作地连接至编码修饰多肽的多核苷酸的重组载体转化表达修饰多肽，并且例如，它可为属于以下的微生物:埃希氏菌属、芽胞杆菌属、气杆菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、欧文氏菌属、裂殖酵母属、肠细菌属、接合酵母属、钩端螺旋体属、奇异球菌属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属、德巴利氏酵母属、毛霉菌属、球拟酵母菌属、甲基杆菌属(methylobacter)、沙门氏菌属、链霉菌属、假单胞菌属、短杆菌属或棒状杆菌属。`
[0054]在本发明中，微生物表达具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽。例如，它可为属于芽胞杆菌属、埃希氏菌属、肠细菌属或沙门氏菌属的微生物，优选地属于埃希氏菌属的微生物，和更优选地，大肠杆菌。
[0055]在本发明的实施例中，制备的是利用包括编码本发明的修饰多肽的多核苷酸的重组载体转化的大肠杆菌 CJM2pCL_Pcjl_metAEL、CJM2pCL_Pcjl_metAET 和 CJM2pCL_PcjljnetAEH菌株(实施例2和实验实施例2)，和利用包括编码对甲硫氨酸的反馈调节有抗性和具有本发明的高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的修饰多肽的多核苷酸的重组载体转化的大肠杆菌 CJM2pCL_Pc j l_metA (#11) EL、CJM2pCL_Pcj l_metA (#11) ET 和 CJM2pCL_Pcj l_metA (#11) EH菌株(实施例3和实验实施例2)。在以上菌株中，CJM2pCL_Pcj 1_metA (#11) EL、CJM2pCL_Pc j l_metA (#11) ET 和 CJM2pCL_Pc j l_metA (#11) EH 菌株分别被命名为CA05-0546、CA05-0547和CA05-0548，并在2010年12月14日保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganism),并分别分配登录号KCCMl1145P、KCCM11146P和 KCCMlI147P。
[0056]本发明提供了具有高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的修饰多肽，其中具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽的一部分氨基酸序列被替代。因此，其是有利的，因为当本发明的修饰多肽在表达仅具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽的微生物中进行表达时，具有高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的多肽可被表达，而不用引入编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的外源基因诸如metx。
[0057]在本发明中，以上微生物可为被额外修饰以具有增强的乙酰辅酶A合成酶活性或被额外修饰以具有对CoA积累的反馈抑制有抗性的泛酰酸激酶活性，以产生大量O-乙酰高丝氨酸的微生物。
[0058]在本发明中，乙酰辅酶A合成酶和泛酰酸激酶来自各种的微生物，并且编码具有这些活性的蛋白质的基因通常分别被称为acs和coaA。
[0059]在本发明中，乙酰辅酶A合成酶活性的增强可通过修饰编码乙酰辅酶A合成酶的acs基因的启动子区和5’_UTR区的核苷酸序列增强基因表达而实现，蛋白质的活性可通过在相应基因的ORF区中引入突变而增强，和蛋白质表达水平可通过在染色体上引入相应基因的额外拷贝或通过将具有自启动子或增强的其他启动子的相应基因引入菌株中而增强。
[0060]更具体地，乙酰辅酶A合成酶活性可通过活性-增强的启动子的替代、诱导启动子突变用于增强活性或增加基因拷贝数而增强，并且因此，本发明提供了改进O-乙酰高丝氨酸生产力的方法，和由该方法制备的大肠杆菌。对于活性增强的启动子的替代，可使用已知具有增强活性的pTac、pTrc、pPro、pR和pL。
[0061]根据一个优选的实施方式，本发明提供了产生O-乙酰高丝氨酸的菌株，其中参与乙酰辅酶A生物合成的acs基因通过用组成型表达启动子、pro启动子替代它的启动子而被过表达。pro启动子可为SEQ IDNO: 30的一部分或全部。
[0062]本发明进一步提供了一种微生物，其引入有对CoA生物合成途径中CoA积累的反馈抑制有抗性的被修饰的泛酰酸激酶。更具体地，泛酰酸激酶的氨基酸序列中的位置106处的氨基酸精氨酸由丙氨酸(SEQID NO:40)替代，以便它变为对CoA积累的反馈抑制有抗性，这导致O-乙酰高丝氨酸生产力的改善。
[0063]在本发明中，以上微生物可为如此微生物，其中选自编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(PPC)、编码天冬氨酸转氨酶的基因(aspC)和编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因(asd)的一种或多种基因的拷贝数被增加，或基因的启动子由活性增强的启动子代替，或被突变为具有增强的活性。
[0064]在本发明中，一系列酶具有从磷酸烯醇丙酮酸盐合成O-乙酰高丝氨酸的活性，如以下反应方案中所示的。因此，细胞中O-乙酰高丝氨酸的积累可通过增强具有这些活性的基因的表达进行诱导。
[0065]磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)
[0066]磷酸烯醇丙酮酸盐+H20+C02〈->草酰乙酸盐+磷酸盐
[0067]天冬氨酸转氨酶(aspC)
[0068]草酰乙酸盐+谷氨酸〈_>天冬氨酸+a_酮戊二酸盐
[0069]天冬氨酸激酶(thrA)
[0070]天冬氨酸+ATP〈->天冬氨酰-4-磷酸+ADP
[0071]天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)
[0072]天冬氨酰-4-磷酸+NADPH〈_>天冬氨酸-半醛+磷酸盐+NADP+高丝氨酸脱氢酶(thrA)[0073]天冬氨酸-半醛+NADPH〈_>高丝氨酸
[0074]在该反应方案中，编码双功能酶天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的thrA基因先前通过实验实施例2中CJM2菌株的反馈抑制的减轻(relief)来增强,和剩余的三种酶可通过基因拷贝数增加、将以上基因的启动子替代成活性增强的启动子或诱导启动子突变以增强活性来增强。
[0075]如本文所用，术语“拷贝数增加”表示将期望基因额外引入染色体或通过引入具有编码相应酶的基因的质粒。
[0076]在本发明的实施例中，CJM2-AP菌株通过以下进行制备:缺失metA和metB缺失的CJM2菌株的acs启动子，并将其替代为pro启动子，并随后转化以具有抗反馈coaA，以便制备具有增加的乙酰辅酶A集中的CJM2-AP/C0菌株，随后是制备具有三种基因ppc、aspC 和 asd 中的两种拷贝的 CJM3 菌株。在下文中，pCL_Pcjl_metA#ll (EL)、pCL_Pcjl_metA#11 (EH)和 pCL_Pcjl_metA#ll (ET)-引入的 CJM3 菌株被分别命名为 CA05-0578、CA05-0579和CA05-0580，并在2011年12月12日保藏在韩国微生物保藏中心，并分别分配登录号 KCCMl 1228P、KCCMl 1229P 和 KCCM11230P (实验实施例 2)。
[0077]仍然在另一方面，本发明提供了生产O-乙酰高丝氨酸的方法，包括以下步骤:培养包括编码修饰多肽的多核苷酸的微生物或用可操作地连接至编码修饰多肽的多核苷酸的重组载体转化的微生物，和获得在以上微生物的培养期间产生的O-乙酰高丝氨酸。
[0078]在本发明中，可以使用本领域已知的合适的培养基和条件，实施利用表达修饰多肽的微生物生产O-乙酰高丝氨酸。本领域技术人员很好地理解培养方法可根据所选择的菌株容易地调整。
[0079]培养方法的例子包括但不限于分批、连续和补料分批培养。在培养中使用的培养基必须满足具体菌株的培养条件。
[0080]在本发明中使用的培养`基可包括蔗糖、葡萄糖、甘油和醋酸或其组合中的任一个碳源，和使用的氮源以有机氮源`和无机氮源或其组合为例，所述有机氮源诸如蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物、麦芽提取物、玉米浆和豆粉，所述无机氮源诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。
[0081]培养基可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐作为磷酸盐来源。培养基也可包括金属盐，诸如硫酸镁或硫酸铁。另外，也可添加氨基酸、维生素和合适的前体。培养基或前体可以以分批型或连续型被添加至培养物。培养物的PH可在培养期间，通过适当添加化合物诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸和硫酸进行调整，和可在培养期间，通过使用消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯，抑制泡沫产生。
[0082]为了保持培养物的需氧条件，氧气或含氧气体可被注入培养物。为了保持厌氧和微需氧条件，可不注入气体或可注入氮气、氢气或二氧化碳。培养物的温度可为27°C至37°C，和优选地30°C至35°C。可继续培养时段，只要产生期望的物质，并且优选地持续10至100小时。
[0083]下文，本发明将参考实施例和实验实施例更详细地进行描述。然而，这些实施例仅为了说明性目的，并且本发明不意欲被这些实施例所限制。
[0084]实施例1:包括高丝氨酸O-琥珀酰转移酶和高丝氨酸O-乙酰转移酶的质粒的构建[0085]利用从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)购买的大肠杆菌W3110菌株(登录号ATCC9637)的染色体作为模板和SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的引物实施PCR，以扩增编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因。
[0086]用于PCR中的引物基于NIH Gene Bank中登记的NC_000913的大肠杆菌染色体的序列制备，和SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2的引物分别具有EcoRV和HindIII限制位点。