专利名称:氨基酸分离方法本发明涉及从含至少两种氨基酸的混合物中分离氨基酸的方法，特别是从蛋白质水解产物中分离氨基酸的方法。已有多种制备氨基酸的方法，其中最常用的是化学或生物化学合成法。这些方法一般能得到以单一氨基酸溶液为主的制剂，单一氨基酸的提取及其纯化通常可达到可靠的工业生产水平。但至今尚有某些氨基酸还难以在工业上以化学或发酵法制得。氨基酸在蛋白质内部完全呈浓缩态，为所有动植物的组成部分;因此人们不断寻求从蛋白质水解物中提取氨基酸的途径。在蛋白质中，氨基酸为多达20种左右的混合物。已尝试过多种分离这些氨基酸的方法。事实上，值得注意的是所有氨基酸的物化性质都甚为相似，均存在于生物体内且常常没有真正的主要组成部分，这就增加了其分离的困难程度。文献已报告的方法中，人们已尝试过的有沉淀法，但此法分离效果不太好且必须回收沉淀试剂又使该方法复杂化;离子交换法，但此法因交换柱尺寸宏大且高度稀释溶液及其连续作用方式而难实施。从USP2，894，954中还可知用脂肪醇从氨基酸溶液中选择性分离氨基酸的方法，但溶剂萃取能力一直很低，虽然这一缺点可通过添加己基胺来部分地加以克服，但即使在这后一种情况下，选择性也非常差。任何一种现有技术方法均不能以低于纯粹化学或生物合成法成本的廉价从氨基酸混合物中分离出市场上需求的多种氨基酸如精氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸和组氨酸等。本发明因此而提出了氨基酸分离方法，其特征是于至少一种醇，酮，醚和/或至少一种烃中用有机磷酸从汲尽胱氨酸后含至少两种氨基酸的混合物中逆流选择分离液态氨基酸。本发明所用氨基酸混合物可来源于生化合成，化学后成，蛋白质水解，生物转化等的产物，而所用蛋白质又可有角蛋白，农产品，动物，血红蛋白等各种来源。
本发明优选的蛋白质水解产物尤其是各种废弃角蛋白如头发，羊毛，羽毛，角，蹄等的水解产物。水解是用强无机酸如硫酸或盐酸，强碱如钠碱或钾碱和酶在可变的时间尤其是在6-24小时内于同样是可变的温度但优选为约100℃下可靠地进行的，特别是进行化学水解。在汲尽胱氨酸特别是用钠碱于高pH值下经沉淀脱除胱氨酸之前或之后，必要时可将所得酸液浓缩。
含至少两种氨基酸的混合物，优选是蛋白质水解产物混合物中的氨基酸浓度最低为100g/l，优选是高于200g/l。
这种酸液再逆流与由有机磷酸，优选为具有6-14，更优选为具有8-10个碳原子的直链或支化脂肪醇和/或脂肪烃组成的有机萃取液接触。
有机磷酸选自二烷基磷酸，二烷基膦酸，二烷基次膦酸，二芳基磷酸，二芳基膦酸，二芳基次膦酸等，而特别优选的是2-二乙基己基磷酸。
二烷基或二芳基磷酸如下式(Ⅰ)
其中R1和R2为具有1-18个碳原子的芳基和/或脂肪基其中至少有一个具有4-15个碳原子。
二烷基或二芳基膦酸如下式(Ⅱ)
二烷基或二芳基次膦酸如下式(Ⅲ)
其中R1和R2同前述式(Ⅰ)定义。
可用的醇，酮和醚尤其选自具有至少5个碳原子的化合物。
优选用具有8-10个碳原子的直链或支化醇，更优选用2-乙基己醇。
可用的烃选自不溶于水的有机磷酸稀释剂如具有至少5个碳原子的直链或支化脂肪烃，芳烃，囟代烃等，也可用其混合物，特别是石油馏分如煤油或SolvessoR。
优选用煤油，更优选用醇-煤油混合物。
本发明优选萃取剂包括以下体积比的混合物-2-二乙基己基磷酸40-80%-2-乙基己醇5-20%-煤油55-0%市场上需求的主要氨基酸如缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，精氨酸和组氨酸可按下萃取工艺从汲尽胱氨酸的蛋白质水解产物液中提取出来。
-苯丙氨酸可于介质硫中于pH10用季铵盐从氨基酸液中萃取出来;季铵盐可选自氯化季铵盐(R3N+CH3Cl-)或硫酸季铵盐[(R3N+CH3)2SO4](R中有8-10个碳原子);这些产品的市售商名常为Adogen 464和Aliquat 336;尤其可用其3-20%(重量)的Solvesso
液。
-精氨酸可用预先调至pH2.7和7的萃取剂经双重萃取分离出来。
-亮氨酸可用pH3萃取剂萃取出来。
-异亮氨酸可用pH3采取剂从汲尽了苯丙氨酸的溶液中萃取出来。
本发明用下述实例进行详细说明，这些实例不能理解为是对本发明的限制。
实例1从汲尽了胱氨酸的羽毛水解产物中分离氨基酸，pH2.7时水解产物组成如下-亮氨酸 21g/l-异亮氨酸 11.3g/l-苯丙氨酸 15g/l-精氨酸 24.5g/l-缬氨酸 17g/l-丝氨酸 39.5g/l-苏氨酸 15g/l-脯氨酸 37.6g/l-丙氨酸 15g/l-谷氨酸 33.8g/l-天冬氨酸 24.5g/l-甘氨酸 26.3g/l-赖氨酸 5.6g/l
-蛋氨酸 1.9g/l-组氨酸 3.7g/l-NaCl 150g/l氨基酸总量为291.7g/l。将此溶液与如下组成的萃取液接触2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%这一操作在图1所示装置中于逆流操作且理论上为9级的液-液萃取器1中进行。溶剂以100ml/h的流量从第1级，而氨基酸液于pH2.7以100ml/h的流量从第5级引入该萃取器。从第9级以40ml/h的流量引入10N盐酸中含氯化钠80g/l的溶液以进行选择性洗涤。再以10ml/h的流量将10N钠碱加入第2和5级的混合器中以在萃取时维持pH2.7。
从第1级出来的汲尽水相B中包含-精氨酸 17.5g/l-组氨酸 2.6g/l-赖氨酸 4g/l-谷氨酸 24.1g/l-甘氨酸 18.8g/l-天冬氨酸 17.5g/l-丝氨酸 28.2g/l-苏氨酸 10.7g/l-丙氨酸 10.7g/l
-脯氨酸 26.8g/l-缬氨酸 ＜60ml/l-苯丙氨酸 ＜50ml/l-蛋氨酸 ＜6mg/l-亮氨酸 ＜15mg/l-异亮氨酸 ＜8mg/l-NaCl 100g/l这相当于萃取率高于·99.5%(对于缬氨酸，蛋氨酸和苯丙氨酸)·99.9%(对于亮氨酸和异亮氨酸)从萃取器1排出的溶剂引入3级萃取器2，其中将该溶剂与流量为25ml/h的2N盐酸溶液逆流接触以从中回收萃取出的氨基酸水溶液。所得氨基酸水溶液A的组成如下-亮氨酸 84g/l-异亮氨酸 45.2g/l-苯丙氨酸 60l/l-缬氨酸 68l/l-蛋氨酸 7.6g/l-其它氨基酸 ＜2.4g/l氨基酸液B中继续以10ml/h的流量添加10N钠碱以将其调至pH7。所得溶液组成如下-精氨酸 16.3g/l
-组氨酸 2.5g/l-赖氨酸 3.7g/l-谷氨酸 22.4g/l-甘氨酸 17.5g/l-天冬氨酸 16.3g/l-丝氨酸 26.3g/l-苏氨酸 10g/l-丙氨酸 10g/l-脯氨酸 25g/l-其它氨基酸 ＜0.2g/l-NaCl 92g/l再将此液与如下组成的萃取液接触2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%这一操作在图1所示装置中于逆流操作且理论上为20级的液-液萃取器3中进行。溶剂以150ml/h的流量从第1级，而氨基酸液以150ml/h的流量从第7级引入该萃取器。选择性洗涤用流量为80ml/h的含氯化钠80g/l的溶液进行。再用以5ml/h的流量引入混合器3和7中的10N钠碱将萃取时的pH维持在7。
从第1级出来的汲尽水相F中含99%以上的每一种氨基酸即赖氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，脯氨酸，丙氨酸，组氨酸和其它氨基酸以及少于150mg/l的精氨酸，这相当于精氨酸萃取率高于99%。溶液F组成如下-赖氨酸 2.4g/l-谷氨酸 14.6g/l-甘氨酸 11.4g/l-天冬氨酸 10.6g/l-丝氨酸 17.1g/l-苏氨酸 6.5g/l-丙氨酸 6.5g/l-脯氨酸 16.2g/l-组氨酸 1.6g/l-其它氨基酸 ≤0.12g/l-精氨酸 ≤0.15g/l-NaCl 80g/l从萃取器3中排出的含精氨酸的溶剂引入3级萃取器4，在其中将其与流量为25ml/h的2N盐酸溶液逆流接触以从中回收以水溶液萃取出的精氨酸。
所得水相为含97.8g/l的精氨酸和少于3g/l的其它氨基酸的水溶液。
汲尽水相F再与如下组成的有机相接触2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%这一操作在图1所示装置中于逆流操作且理论上为19级的液-液萃取器12中进行。水溶液F以230ml/h的流量从第10级，而萃取剂以27ml/h的流量从第1级引入萃取器。选择性洗涤是用以88.5ml/h的流量从第19级引入的0.15N盐酸溶液进行的。10N钠碱以15ml/h的流量从第1级引入。
在此条件下，从第1级出来的汲尽水相G中含少于25mg/l的组氨酸和高于99.9%的引入液F中的其它各种氨基酸。这相当于组氨酸萃取率高于99.9%。将从第19级出来的含组氨酸的溶剂引入逆流操作且理论上为3级的液-液萃取器13，在其中将其与流量为10ml/h的2N盐酸溶液接触以从中回收以水相萃取出的组氨酸，可得到含37.5g/l的组氨酸和少于5mg/l的其它氨基酸的水相，即组氨酸纯度至少为99.95%。
取第一次分离所得的再生提取物(记为A)并继续以15ml/h的流量添加10N钠碱而进行中和。
溶液A的组成如下-亮氨酸 52.5g/l-异亮氨酸 28.5g/l-苯丙氨酸 37.5g/l-缬氨酸 42.5g/l-蛋氨酸 4.8g/l-其它氨基酸 ≤1.5g/l-NaCl 80g/l再将其与如下组成的有机相接触2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%这一操作在图1所示的装置中于逆流操作且理论上为24级的液-液萃取器5中进行。溶剂以170ml/h的流量从第1级，而氨基酸以40ml/h的流量从第12级引入该萃取器。选择性洗涤是用以55ml/h的流量引入的1.25N盐酸溶液进行的。10N钠碱以10ml/h的流量从第1级引入。从第1级出来的汲尽水相C含高于99.8%的每一种氨基酸缬氨酸，蛋氨酸和其它氨基酸以及少于10mg/l的亮氨酸，异亮氨酸和苯丙氨酸，这相当于这三种氨基酸的萃取率高于99.9%。
溶液C组成如下-缬氨酸 17.9g/l-蛋氨酸 2g/l-其它氨基酸 ≤0.6g/l-亮氨酸 ＜10ml/l-异亮氨酸 ＜10mg/l-苯丙氨酸 ＜10mg/l-NaCl 33g/l从萃取器5出来的溶剂引入3级萃取器6，在其中将其与以40ml/h引入的2N硫酸逆流接触以从中回收以水相萃取出的氨基酸。所得水相D的组成如下-亮氨酸 52.5g/l-异亮氨酸 28.5g/l-苯丙氨酸 37.5g/l-其它氨基酸 ≤0.2g/l该溶液继续用10N钠碱以8ml/h的流量进行中和，这时溶液的组成如下-亮氨酸 42.7g/l-异亮氨酸 23.7g/l-苯丙氨酸 37.7g/l-其它氨基酸 ≤0.2g/l-Na2SO4142g/l继续与如下组成的有机相逆流接触而从中萃取出苯丙氨酸Aliquat
336 15%(以氯化物形式)Solvesso
150 85%这一接触操作在图1所示装置中于理论上为16级的液-液萃取器7中进行。溶剂以140ml/h从第1级，而氨基酸液以48ml/h的流量从第8级引入该萃取器。选择性洗涤用从第16级引入的流量为26ml/h的0.7N硫酸液进行。
以3ml/h从第1级引入10N钠碱。在这种条件下，萃取出的苯丙氨酸在溶剂中的纯度为99.9%，萃取率为99.7%。
从第1级出来的汲尽水相E的组成如下-亮氨酸 28.4g/l-异亮氨酸 15.4g/l-其它氨基酸 ≤0.1g/l-Na2SO492g/l从萃取器7出来的含苯丙氨酸的溶剂引入3级萃取器8，其中将其与以24ml/h的流量引入的2N硫酸溶液逆流接触以从中回收以水相萃取出的苯丙氨酸，可得到含苯丙氨酸87.5g/l和其它氨基酸少于0.1%的水溶液。
将主要含亮氨酸和异亮氨酸的汲尽液E引入逆流操作且理论上为21级的液-液萃取器9中。
从第1级以90ml/h的流量向该萃取器中引入如下组成的溶剂2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%氨基酸液以74ml/h从第12级引入。选择性洗涤用以130ml/h的流量从第21级引入的0.34N硫酸溶液进行。再以4ml/h的流量从第1级引入10N钠碱。在这种条件下，汲尽水相为含纯度高于98.8%的异亮氨酸5.6g/l的水溶液。
含亮氨酸的溶剂引入逆流操作且理论上为3级的液-液萃取器10中，其中萃取出的亮氨酸再与以20ml/h的流量引入的2N盐酸溶液接触而以水相得到回收，可得到含纯度至少为99.8%的亮氨酸105g/l的水溶液。
实例2取实例1中第1次分离所得的再生提取物(记为A)并继续以15ml/h的流量添加10N钠碱而进行中和。
溶液组成如下-缬氨酸 42.50g/l-亮氨酸 52.50g/l-异亮氨酸 28.50g/l-苯丙氨酸 37.50g/l-蛋氨酸 4.15g/l
-酪氨酸 4.75g/l-其它氨基酸 ≤1.50g/l-Na2SO4142g/l再将其与氯化物形式的Aliquat
以15%(体积)溶入煤油中构成的有机相接触。
这一操作在图2所示装置中于逆流操作且理论上为16级的液-液萃取器5中进行。溶剂以117ml/h的流量从第1级，而氨基酸液以40ml/h的流量从第8级引入该萃取器。选择性洗涤是用以22ml/h的流量从第16级引入的0.85N硫酸溶液进行的。从第1级以2.5ml/h的流量引入10N钠碱。
在这种条件下，苯丙氨酸在溶剂中的纯度为99.9%，其萃取率为99.7%。从该萃取器出来的含苯丙氨酸的溶剂引入3级萃取器6，其中将其与以20ml/h的流量引入的2N硫酸溶液逆流接触以从中回收以水相萃取出的苯丙氨酸，可得到含苯丙氨酸75g/l和其它氨基酸少于0.1%的水溶液。
从第1级出来的汲尽液C的组成如下-亮氨酸 33.9g/l-异亮氨酸 18.4g/l-缬氨酸 27.4g/l-蛋氨酸 3.1g/l-酪氨酸 3.1g/l-Na2SO4142g/l-其它氨基酸 ≤1g/l再将其与如下组成的有机相接触2-二乙基己基磷酸 75g/l2-乙基己醇 10g/l
煤油 15g/l这一操作在图2所示装置中于逆流操作且理论上为21级的液-液萃取器7中进行。溶剂以218ml/h的流量从第1级，氨基酸液以62ml/h的流量从第11级引入该萃取器。选择性洗涤用流量为156ml/h的0.7N硫酸溶液进行。从第1级以13.5ml/h的流量引入10N钠碱。
从第1级出来的汲尽水相D含高于99.8%的每一种氨基酸，即缬氨酸，蛋氨酸，酪氨酸和其它氨基酸以及少于10ml/h的亮氨酸和异亮氨酸，这相当于这两种氨基酸的萃取率为99.9%。溶液D的组成如下-亮氨酸 ≤10mg/l-异亮氨酸 ≤10mg/l-缬氨酸 7.8g/l-蛋氨酸 0.9g/l-酪氨酸 0.87g/l-其它氨基酸 ≤0.3g/l-Na2SO440g/l从萃取器7排出的溶剂引入3级萃取器8，其中将其与2N盐酸液接触以从中回收萃取出的氨基酸，主要为亮氨酸和异亮氨酸。用10N钠碱中和之后，该溶液E的组成如下-亮氨酸 40g/l-异亮氨酸 28.50g/l-其它氨基酸 ≤0.1g/l
将其引入逆流操作且理论上为21级的萃取器9中。如下组成的溶剂2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%以18ml/h的流量从第1级，而氨基酸液以40ml/h的流量从第12级引入该萃取器。选择性洗涤是用流量为70ml/h的0.5N盐酸进行的。从第1级以1.2ml/h的流量引入10N钠碱。在这种条件下，汲尽水相为含纯度高于98.8%的异亮氨酸10.4g/l的溶液。
排出的含亮氨酸的溶剂在理论上为3级的萃取器10中与以10ml/h的流量引入的2N盐酸溶液逆流接触，可得到含纯度至少为99.8%的亮氨酸160g/l的水溶液。
实例3通过添加浓盐酸将5ml于pH7.5下进行转氨反应反应所得的含0.093摩尔L-苯丙氨酸和0.052摩尔天冬氨酸的溶液调至pH2.9。再向此溶液中添加5ml如下体积组成的混合物-双(2-乙基己基)磷酸 75%-2-乙基己醇 10%-煤油 15%搅拌混合物后进行两相分离并测定两相的氨基酸含量。初始溶液中L-苯丙氨酸的94.2%转移到了有机相而L-天冬氨酸的95%留在水相中。
实例4在调至pH2.9的450ml与实例1相同的溶液中加入如下体积组成的混合物450ml-双(2-乙基己基)磷酸 50%-2-乙基己醇 6.7%-煤油 43.3%将此混合物搅拌，再进行滗析使之两相分离。有机相用等体积的2N盐酸逆流萃取。对第一级萃取后水相中的L-苯丙氨酸分析表明87%的L-苯丙氨酸已萃取出来了。
实例5通过添加浓盐酸将5ml含0.05摩尔色氨酸，0.05摩尔L-丝氨酸和0.083摩尔甘氨酸的水溶液调至pH3。再向此溶液中添加5ml如下体积组成的混合物-双(2-乙基己基)磷酸 75%-2-乙基己醇 10%-煤油 15%将此混合物搅拌，再进行滗析使之两相分离。对水相的分析表明96%的L-色氨酸已在有机相中萃取出来，而L-丝氨酸和甘氨酸的95%以上仍保留在水相中。
实例6用浓盐酸将5ml含0.05摩尔L-色氨酸，0.3摩尔L-丝氨酸和0.75摩尔甘氨酸的水溶液调至pH3。再向此溶液中添加5ml与实例5相同组成的萃取剂混合物。
搅拌和分析之后，对水相的分析表明97%的L-色氨酸已转入有机相，而萃取出来的L-丝氨酸和甘氨酸少于5%。


本发明涉及氨其酸的分离方法，其中于至少一种醇，酮，醚和/或至少一种脂肪烃中用可能成液态的有机磷酸从汲尽胱氨酸后含至少两种氨基酸的混合物中逆流选择性萃取出氨基酸。