专利名称：大麦木糖异构酶基因的功能及其应用的制作方法植物的木质纤维素中可发酵糖主要为葡萄糖和木糖，后者占木质纤维素的25%。但是，大部分能够发酵葡萄糖以制备こ醇的酵母(如酿酒酵母)不能够以木糖作为碳源。如果能够将植物的木质纤维素中的木糖异构化，生成木酮糖，木糖就可以作为碳源进行こ醇发酵。而若能找到高效的木糖异构酶(D-xylose isomerase, XI),催化五碳糖D-木糖转化 为D-木酮糖，便可达到此目的。现有技术的木糖异构酶基因多来自于微生物。如Escherichia coli, Bacillussubtilis,Thormotoga species,Thermus species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在こ醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30°C左右的こ醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。因此，发现新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶，提供能够转化木糖生成木酮糖的酵母工程菌，井能克服现有技术的限制，即在30°C左右的こ醇发酵温度下具有足够的酶活，很有必要。
本发明的目的是从大麦中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使所得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。本发明人通过分析数据库大麦基因组序列的方式，首次从大麦基因组序列中发现了具有木糖异构化功能的基因(GenBank NO. X95257)，并将其命名为“大麦木糖异构酶基因”。并通过实验发现，该基因编码的木糖异构酶在宿主细胞中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。现有技术的文献仅在转录水平上证实了基因(GenBank NO. X95257)的存在，但未公开过其所具有的任何功能，以及可利用该基因做何种用途的研发。本发明构建了具有大麦木糖异构酶基因的重组质粒，并将该质粒导入了酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母赋予了该转化能力。本发明进行了如下具体工作I.提取大麦mRNA，反转录生成cDNA，用保守引物克隆得大麦木糖异构酶基因，其大小为1443bp。2.将大麦木糖异构酶基因片段连接到PYES2质粒载体中，构建具有完整木糖异构酶基因的重组质粒pYES-WXI。3.将含大麦木糖异构酶基因的重组质粒pYES-WXI通过电击转化方法导入不具将木糖转化为木酮糖的能力的酿酒酵母中，获得能够将木糖转化为木酮糖的遗传工程酵母菌株W(详见实施例5)。因此本发明的木糖异构酶基因有益效果是大麦木糖异构酶基因赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。且大麦木糖异构酶基因工程菌株的木糖利用率可达51. 78 %，大大高于对照菌株(详见实施例6)。4、将(一)中提取的RNA液于65°C温育5min后迅速冷却至室温，加入等体积2 X柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后，加入I倍柱床体积的IX层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD26tl,当洗出液中OD26tl为0时，加入2_3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。6、测定OD26tl,合并含有RNA的洗脱组分。7、加入1/10体积的3MNaAc (pH5. 2)，2. 5倍体积的冰冷こ醇，混匀，_20°C 30min。8、4°C下12000g离心15min,小心弃去上清液,用70%こ醇洗漆沉淀,4°C下12000g离心5min。9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥IOmin,或真空干燥lOmin。10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70 %こ醇中并贮存于-70 0C )。(三)反转录生成cDNAI、在冰浴的试管中加入如下反应混合物模板RNA 1-5 U g 总 RNA (DNase 处理后)引物oligo(dT)无RNA 酶去离子水(RNase-free ddH20):定容至 12 U I。2、轻轻混匀后离心3_5s。反应混合物在70°C水浴5min后，冰浴30s，然后离心3 5s03、将试管冰浴，再加入如下组分5 X Reaction Buffer 4 U IRNasin (20U/U I) 1 U IdNTP mix(IOmM) 2u I4、轻轻混匀后离心3-5s。37°C水浴5min，加入I iilMMLV(20U/yl)，终体积为20 u I。5、反应混合物37°C水浴60min。在70°C加热IOmin结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。实施例2木糖异构酶基因的序列用保守引物从反转录得到的大麦cDNA中克隆到ー个约I. 5kb的片段，测序分析发现含有ー个1443bp的ORF序列，比对证实是大麦的木糖异构酶基因(GenBank登录号X95257)。DNA测序由上海生エ生物公司完成，核苷酸和氨基酸分析软件主要为DNAMAN和美国国家生物技术信息中心(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/, National CenterforBiotechnology Information, NCBI)的 Blast 程序。
实施例3木糖异构酶基因表达载体质粒的构建用编码大麦木糖异构酶的基因的5’和3’端序列设计引物，包括Mfe I和xba I位点。用Mfe I和xba I酶切PCR产物。终产物被克隆到由pYES2产生的载体上。在该载体中，pYES2上的GAU启动子用TPIl启动子替换来确保木糖异构酶的组成型表达，从而消除培养基中对半乳糖的需求。TPIl启动子从酿酒酵母基因组克隆得到。该启动子被酶切成Nhe I-EcoR I片段。TPIl启动子和木糖异构酶的编码基因的PCR产物都被连接到用Spe I和Xba I剪切的pYES2上，最终得到含木糖异构酶基因的重组质粒pYES-WXI。大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒的转化I)感受态细胞的制备(氯化钙转化法)①从活化的大肠杆菌(E. coli)BL21平板上挑取单菌落接种到含5ml的LB液体培 养基的试管中，37°C振荡培养2. 5h至3h使菌液的0D_值达到0. 4至0. 6，冰上冷却培养物至(TC②将培养物倒入无菌的I. 5ml的离心管中③4°C, 4000rpm 离心 IOmin④弃上清，收集菌体⑤用预冷的0. 5ml的0. IM的CaCl2重悬菌体,离心,弃上清⑥用预冷的0. 5ml的0. IM的CaCl2重悬菌体，冰浴15min，离心，弃上清⑦加入200 U I的预冷的0. IM的CaCl2重悬菌体，冰浴放置2)质粒转化感受态细胞①取0. 5ul质粒加于一管感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min②将离心管置于42°C水浴中热激90s，不要晃动离心管③迅速将离心管置于冰上，冷却2min④加入800ul的LB液体培养基，37°C，200rpm摇床培养45min⑤取50ul的培养液涂布于含氨苄青霉素(50 u g/ml)的LB固体平板上，37°C培养12至16小时，检查转化菌落⑥挑选单菌落，接种到含5ml的LB液体培养基的试管中，37°C振荡培养提取质粒酶切验证为正确的转化子，然后测序证明含有木糖异构酶基因。实施例4工程菌株的构建将含木糖异构酶基因的重组质粒pYES-WXI经电击转化法转入不具将木糖转化为木酮糖能力的酿酒酵母CEN. PK113-5D中，在以2%葡萄糖作为碳源的SC培养基平板上筛选转化子。未被转化的细胞不能在这些平板上生长。PCR鉴定证明W转化子含有带大麦木糖异构酶基因的质粒。酿酒酵母感受态细胞的制备及质粒的转化I)酵母感受态细胞的制备(电击转化法)①在含5mlYPD的50ml离心管中，培养酿酒酵母，30°C过夜②取0. 1-0. 5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600 = I- 3-1. 5③在4°C，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞④如上离心，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞
⑤如上离心，用20ml预冷的IM山梨醇悬浮细胞⑥如上离心，用Iml预冷的IM山梨醇悬浮细胞，至终体积约I. 5ml注意可冻存80ul等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多2)质粒电击转化感受态细胞①取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA (溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0. 2cm电转杯中。②在冰上放置5min③根据所使用装置推荐的酿酒酵母參数进行电击④立即加入Iml预冷的IM山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中 ⑤分成200-600ul等份，涂于SC平板上⑥在30度孵育平板至克隆产生，PCR鉴定证明转化子W含有带大麦木糖异构酶基因的质粒pYES-WXI。实施例5工程菌株木糖异构酶酶活的測定I、实验对象实验菌株含pYES-WXI酿酒酵母重组菌株W ；对照菌株含pYES2空载体的酿酒酵母菌株。2、实验方法在以葡萄糖/木糖的混合物为唯一碳源的衡化培养生长，分别测定对照菌株和含PYES-WXI酿酒酵母重组株W的木糖异构酶酶活。酶活的测定按如下方法进行适当酿酒酵母细胞破碎后的上清液(通过OD595测定调整为总蛋白量一致)IOOmMTris-HCl pH7. 0 缓冲液，IOmMMgCl2, 2U SDH (山梨醇脱氢酶，Roche 公司)和
0.15mMNADH(还原型烟胺酸腺嘌呤二核苷酸，Roche公司)，混匀，500mM的木糖启动反应，30°C、340nm下检测NADH被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。木糖异构酶(XI)的ー个酶活单位(U)定义为每分钟转化I U mo I底物。3、具体操作过程①分别挑取单菌落接种在20ml的SC培养液中，30°C 200rpm摇培48h ；②1600g 离心 5min,弃上清，沉淀用 IOmM pH7. 5 的 potassium-phosphatebuffer(含 2mM EDTA)洗两次；③重悬于IOOmM pH 7. 5 的 potassium-phosphate buffer(2mM MgCl2 和ImMdithiothreitoI)；④超声破碎，4度36000g离心20min，上清用做酶活分析和总蛋白測定。4、测定结果对照菌株未测出木糖异构酶酶活；含pYES-WXI酿酒酵母重组株木糖异构酶酶活测定为0. 52U/mg总蛋白。5、结论大麦木糖异构酶基因编码的木糖异构酶在酿酒酵母中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。实施例6工程菌株木糖利用的测定I、实验对象
实验菌株含pYES-WXI酿酒酵母重组菌株W ；对照菌株含pYES2空载体的酿酒酵母菌株。2、实验方法在以葡萄糖/木糖的混合物(初始浓度分别为5. Og/L和7. 5g/L)为卩隹一碳源的衡化培养生长，30°C 200rpm摇培48h，高效液相色谱法(HPLC)測定上清葡萄糖和木糖含量，推算糖利用效率。3、结果
测试结果显示经过48h培养，重组菌株W培养基的葡萄糖几乎完全利用完，木糖利用率达到51.78% ;对照菌株培养基的葡萄糖几乎完全利用完，木糖利用率仅达到
3.02%。4、结论大麦木糖异构酶基因工程菌株的木糖利用率大大高于对照菌株。


本发明发现了来自大麦的基因具有木糖异构酶功能，可转化木糖为木酮糖。本发明构建了包含该基因的重组质粒，并将该质粒导入酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，将木糖异构酶基因在宿主细胞及表达后，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母获得了该转化能力。