转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针的制作方法[0002]甘露糖阳性选择系统属于非抗生素筛选系统之一，它是利用大肠杆菌的磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)作为选择基因，甘露糖作为选择剂进行转基因植物的筛选。甘露糖经由植物内源己糖激酶催化磷酸化为6-磷酸甘露糖，反应消耗ATP和磷酸盐，会导致细胞分裂、生长缺少能量，并且6-磷酸甘露糖的过量积累对植物细胞有毒害作用。整合有外源PMI基因的转化细胞能将6-磷酸甘露糖异构酶为6-磷酸果糖，使得代谢可继续进行，避免了因6-磷酸甘露糖的大量积累，并产生ATP，为细胞的正常代谢提供了能量。非转化细胞因缺乏磷酸甘露糖异构酶，不能利用6-磷酸甘露糖正常生长。因此，在含有甘露糖的培养基上，只有转化细胞能正常生长，而非转化细胞则被淘汰。该选择系统在玉米转基因过程中运用广泛。[0003]在享有转基因技术带来的巨大实惠的同时，转基因产品潜在的生态安全、食品安全问题也日益引起人们的关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。除美国、加拿大、阿根廷和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上大多数国家如欧盟各国、匈牙利、瑞士、波兰、日本、韩国等均制定了强制性标识制度。我国于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，启动了农业转基因生物的监督监管机制。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因作物，应当加以标识，未标识和不按规定标识的，不得进口和销售，因此，必须对转基因产品进行有效的检测。[0004]目前，国内还没有转基因植物中磷酸甘露糖异构酶基因PCR检测试剂盒，本发明可弥补上述缺陷，采用实时荧光PCR的检测方法完成转基因植物中磷酸甘露糖异构酶基因的检测。
[0005]本发明属于转基因植物产品的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因植物产品的磷酸甘露糖异构酶基因的检测用检测方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些产品检测中的局限性，为转基因产品检测提供有效工具，从而加强转基因产品的监督监管，确保产品标签的一致性，保护消费者的知情权和选择权。[0006]本发明的主要原理为:针对保守序列设计一组引物(上游引物:PMI_taqF5，-ccgggtgaatcagcgttta-3，和下游引物:PMI_TAQR 5，-gccgtggcctttgacagt-3，)和一条 TAQMAN 探针(PM1-TAQP:FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94_95°C—定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性集合。Taqman探针的5端标记有报告集团，3端有非荧光淬灭集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3’ 一 5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团原理淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。[0007]本发明涉及的转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因的检测方法，其中的试剂包括如下:
[0008](I) PCR扩增反应液A
[0009]包括10?反应缓冲液、0.1-0.411111101/1dNTP、2_4mmol/L硫酸镁、1-2U Taq 酶、
0.2-0.6 μ mol/L 上游引物、0.2-0.6 μ mol/L 下游引物、0.2-0.6 μ mol/L Taqman 探针；
[0010]其中10XPCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和I %曲拉通X100 ;
[0011]上游引物PM1-taqF:5’ -ccgggtgaatcagcgttta-3’ ；下游引物 PM1-taqR:5’ -gccgtggcctttgacagt-3J ；
[0012]Taqman 探针 PM1-taqP:FAM_tgccgccaacgaatcaccgg_TAMARA
[0013]其中上游引物、下游引物、Taqman探针的体积比为:1: I: 0.6 ；
[0014]其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
[0015]⑵阳性对照DNA
[0016]上面所述PCR扩增反应液A，每管24yL的最佳组成为:2.5 μ L10XPCR反应缓冲液、2 μ L2.5mmol/LdNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、2 μ L25mmol/L硫酸镁、I μ LlO μ mol/L 上游引物、I μ LlO μ mol/L 下游引物、0.6 μ LlO μ mol/L Taqman 探针、
0.3 μ LTaq 酶、14.6 μ LddH20。
[0017]使用上述试剂盒检测转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因的方法，依次包括下列步骤(1)-(3):
[0018](I)待检样品DNA的提取
[0019]DNA提取可使用DNA提取试剂盒或CTAB法。
[0020](2)转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因的实时荧光PCR扩增
[0021]A.在装有24 μ L PCR扩增反应液A的反应管中加入I μ L待检样品DNA，混匀。
[0022]B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0023]95°C 3min, I 个循环；
[0024]950C 30s, 600C 30s，共 40 个循环。
[0025](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

[0026]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0027]实施例1
[0028]按下述方法检测转基因玉米3272，使用59122、BTll、M0N88017、M0N810转基因玉米品系做阴性对照:[0029]包括10XPCR 反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸镁、L 5U Taq 酶、0.4 μ mol/L 上游引物 PM1-taqF:5，-ccgggtgaatcagcgttta-3?；下游引物 PM1-taqR:5，-gccgtggcctttgacagt-3J ；Taqman 探针 PM1-taqP:FAM_tgccgccaacgaatcaccgg_TAMARA。其中10XPCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1%曲拉通X-100 ；
[0030]按照以下程序进行检测:
[0031](I)待测转基因玉米样品DNA的提取
[0032]采用安比奥试剂盒(GenoDNAPlant Mini Kit)
[0033]A.充分研磨
[0034]B.最多每 75mg 鲜料或 15mg 干材料样品中加 400 μ gBufferAPl, 0.5 μ I RNaseA,充分混匀；
[0035]C.在65°C培养lOmin，期间上下颠倒离心管2-3次；
[0036]D.加 130 μ I BufferAP2,混匀，冰上放置 5min, 14000rpm 离心 5min ；
[0037]E.将上清转入新的1.5ml离心管内，加1.5倍体积的BufferAP3/E，颠倒3_4次，混匀；
[0038]F.把溶液小心转入2ml收集管的吸附柱内，1000Orpm离心lmin，如果一次离不完，
可多次加样直至过柱完成，倒掉收集管中的液体；
[0039]G.加 500 μ IBufferAWl`, 1000Orpm 离心 lmin,倒掉收集管中的液体；
[0040]H.加 500 μ I BufferAW2, 1000Orpm 离心 lmin,倒掉收集管中的液体；
[0041]1.重复8步一次；
[0042]G.14000rpm离心3min，将离心柱转移至一干净1.5ml离心管内；
[0043]K.小心加50-100 μ I BufferAE至吸附柱滤膜上，室温静置l_5min, 1000Orpm离心lmin ;4°C保存。也可等同采用CTAB法。
[0044](2)待测转基因植物样品DNA的实时荧光PCR扩增
[0045]A.在PCR反应管中加入24 μ L PCR反应液A和I μ L样品DNA，混匀。
[0046]B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0047]95°C 3min, I 个循环；
[0048]950C 30s, 600C 30s，共 40 个循环。
[0049](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
[0050]实施例2
[0051]按下述方法检测转基因玉米MIR604，使用GTS 40_3_2、M0N89788、A2704-12转基因大豆品系做阴性对照:
[0052]包括10XPCR 反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸镁、1.5UTaq 酶、0.4μ mol/L 上游引物 PM1-taqF:5’ -ccgggtgaatcagcgttta-3’ ；下游引物 PM1-taqR:5，-gccgtggcctttgacagt-3J ；Taqman-MGB 探针 PM1-taqP:FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA。其中 10XPCR 反应缓冲液含有 10Ommol/I, ρΗ8.8 的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1%曲拉通X-100 ；
[0053]按照以下程序进行检测:
[0054](I)待测转基因玉米样品DNA的提取[0055]采用安比奥试剂盒(GenoDNAPlant Mini Kit)
[0056]A.充分研磨
[0057]B.最多每 75mg 鲜料或 15mg 干材料样品中加 400 μ gBufferAPl, 0.5 μ I RNaseA,充分混匀；
[0058]C.在65°C培养lOmin，期间上下颠倒离心管2-3次；
[0059]D.加 130 μ I BufferAP2,混匀，冰上放置 5min, 14000rpm 离心 5min ；
[0060]E.将上清转入新的1.5ml离心管内，加1.5倍体积的BufferAP3/E,颠倒3_4次，混匀；
[0061]F.把溶液小心转入2ml收集管的吸附柱内，1000Orpm离心lmin，如果一次离不完，
可多次加样直至过柱完成，倒掉收集管中的液体；
[0062]G.加 500 μ I BufferAWl, 1000Orpm 离心 lmin,倒掉收集管中的液体；
[0063]H.加 500 μ I BufferAW2, 1000Orpm 离心 lmin,倒掉收集管中的液体；
[0064]1.重复8步一次；
[0065]G.14000rpm离心3min,将离心柱转移至一干净1.5ml离心管内；
[0066]K.小心加50_100μ1 BufferAE至吸附柱滤膜上，室温静置l_5min, 1000Orpm离心lmin ;4°C保存。也可等同采用CTAB法。
[0067](2)待测转基因植物样品DNA的实时荧光PCR扩增
[0068]A.在PCR反应管中加入24 μ L PCR反应液A和I μ L样品DNA，混匀。
[0069]B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0070]95°C 3min, I 个循环；
[0071]95°C 30s，60°C 30s，共 40 个循环。
[0072](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。



[0073]图1玉米3272荧光PCR产物的曲线图。图中坐标轴以外实横线以上为阳性样品，以下为阴性样品或空白对照。
[0074]图2玉米MIR604荧光PCR产物的曲线图。图中坐标轴以外实横线以上为阳性样品，以下为阴性样品或空白对照。