专利名称：一种制备牡丹花雄蕊浸膏的方法实施例I牡丹花雄蕊中功效物质的提取介质研究取0. 500g牡丹花雄蕊4份，置于四个小烧杯中，分别加入SmL纯净水、乙醇、石油醚、乙酸乙酯，浸泡I小时后，观察溶液的颜色，可发现纯净水溶液显示的黄色〉乙醇溶液〉石油醚溶液〉乙酸乙酯溶液。过滤得到的4种溶液，分别进行全波长扫描，若出现平头峰则稀释后重复操作，直至全波长扫描图中无平头峰为止。分析4个样品的结果后得出纯净水为最佳溶剂。牡丹花雄蕊与纯净水比例为1:16 (m/v)。实施例2牡丹花雄蕊中功效物质的高效液相色谱分离及半制备色谱制备条件研究由全波长扫描结果确定检测波长为266nm。设定单任务时间90分钟，进样量10 u L，流速lmL/min，温度室温，分别尝试甲醇水比例为5 5、4 6、3 7、2 8和9 I的流动相，水中加入0. 1%的冰乙酸，流动相使用前混匀，超声处理10分钟以去除其中的气泡。分析各液相色谱图后发现3 7为最佳比例，且60分钟后不再出峰。进一步尝试3.5 6.5， 2.5 7. 5的比例后发现，3 7的甲醇水比例仍为最佳的流动相比例。进而得出最终用于各种样品分析的液相色谱条件单任务时间60分钟,进样量10 u L,流速lmL/min,温度室温，流动相为3 7的甲醇加入0. 1%冰乙酸的纯净水溶液，检测波长为266nm。半制备色谱制备牡丹花雄蕊中功效物质的条件为甲醇水(含0. 1%冰乙酸)=3 7，波长266nm，流速10mL/min，进样量2mL，温度为室温，时间为70min。实施例3牡丹花雄蕊中功效物质分离纯化不同柱材料的筛选将纯净水粗提物经过石油醚、乙酸乙酯萃取后水相等待柱层析上样。本技术采用聚酰胺、大孔树脂AB-8、大孔树脂XAD-16三种柱层析材料进行分离纯化效果对比试验。实验采用湿法上样，取20mL浓缩后的样品上样，依次使用纯净水、30%乙醇、60%乙醇和无水乙醇进行洗脱，洗脱速度控制在40-50滴/min，下方根据洗脱色素带用试管接液，标明洗脱液浓度4及编号后采用高效液相色谱进行分离效果比较。检测结果为大孔树脂AB-8分离纯化效果最佳。实施例4牡丹花雄蕊浸膏清除ABTS自由基的IC50值确定将提取物按照浓度梯度I、1/2、1/5、1/10、1/20进行样品准备。准备好的样品加3. 6mL ABTS-溶液，用振荡器混匀，反应6分钟，同时以0. 4mL水作为测试样品按上述操作制成阴性对照液，每种浓度下制作3个平行。用紫外分光光度计测试反应后的样品及阴性对照液在734nm波长下的吸光度，取三个平行实验所得结果的平均值进行计算。按公式(A阴性对照-A)X100/A阴性对照求得ABTS*自由基清除率(%)。WABTS*自由基清除率(%)为纵轴，测试样品的浓度为横轴作图，得出回归直线，ABTS*自由基清除率(%)为50时的样品浓度即为样品对ABTS*自由基的半抑制浓度，IC50。结果为IC50值为0.914 mg/mL。实施例5牡丹花雄蕊浸膏的制备1)将牡丹花雄蕊与纯净水按照质量体积比1:16浸泡40分钟得到牡丹花雄蕊功效物质粗提溶液；2)将步骤I获得的粗提溶液通过旋转蒸发仪在50°C温度下浓缩至原来体积的1/3后经过石油醚、乙酸乙酯在25°C条件下萃取3次，直至溶于石油醚、乙酸乙酯的物质去除干净。 然后用无水乙醇在_18°C以下进行冷冻醇沉12小时后解冻过滤并将乙醇蒸发掉得提取液；
3)将步骤2获得的提取液通过半制备高效液相色谱仪，色谱条件为甲醇水(含有
0.1% 冰乙酸)(v/v)=3:7，流速 I. 0 mL/min，进样量 10. 0 uL，检测波长 266 nm，温度 25。。， 时间80 min。再收集提取液。4)将3获得的提取液进行柱层析分离纯化。将大孔树脂AB-8采用湿法装柱，用去离子水冲至水PH 7.0后等待上样。将提取液上样后分别采用去离子水、30%乙醇、60%乙醇和无水乙醇洗脱样品后通过高效液相色谱分析流出组分，液相色谱条件为甲醇水(含有
0.1% 冰乙酸)(v/v)=3:7，流速 1.0 mL/min，进样量 10.0 uL，检测波长 266 nm，温度 25°C， 时间80 min。根据不同组分的液相色谱图谱判定组分所含物质是否相同，将含有相同物质的液体进行合并，将合并后的液体通过旋转蒸发仪在50°C温度下浓缩至无有机溶剂蒸出得浓缩液。5)将步骤4获得的浓缩液进半制备高效液相色谱仪制备牡丹花雄蕊中功效物质， 制备色谱条件为甲醇水(含0. 1%冰乙酸)=3 7 (v/v)，波长266 nm，流速10.0 mL/ min,进样量2mL，温度25°C，时间为70min。半制备色谱仪图谱每次出峰时即收集功效物质，将收集后的功效物质液体通过旋转蒸发仪在50°C温度下浓缩至无有机溶剂蒸出得到牡丹花雄蕊浸膏。本发明所使用的石油醚、乙酸乙酯为分析纯。


本发明涉及一种制备牡丹花雄蕊浸膏的方法，具体研究了牡丹花雄蕊中具有抗氧化能力的功效物质的提取、分离纯化方法，并制备了具有抗氧化能力的浸膏。利用本发明得到的牡丹花雄蕊浸膏进行清除ABTS自由基检测，得出清除50%ABTS自由基时浸膏的浓度(IC50)为0.914mg/mL，这说明利用本发明制备的牡丹花雄蕊浸膏具有抗氧化能力，将有助于人体延缓衰老、增加免疫力、养颜护肤等。