用于检测HPV感染细胞产生E6、E7 mRNA的试剂盒的制作方法 【技术领域】，涉及一种用于检测HPV感染细胞产生E6、E7mRNA 的试剂盒。 [0002] HPV病毒侵入子宫颈基底膜，被感染的细胞一部分横向扩散，另一部分迁移到鳞状 上皮细胞，病毒整合到鳞状上皮细胞中，然后大量繁殖，受感染的鳞状上皮细胞逐步演变成 CIN1、CINII、CINIII，直至宫颈癌，但是并非所有被感染的细胞都会转换成癌细胞。目前， 宫颈癌的诊断及检测方法主要有组织病理学检测法、TCT(液基薄层细胞学技术）检测法、 HPV-DNA检测法，这些检测方法的优缺点如下： [0003] 组织病理检测法：有时很难将CIN与非瘤病变、不同级别的CIN准确鉴别开来， 而不同级别的CIN治疗是不同的，且有一定的创伤；TCT:重复性不好，会受环境及医师经 验等因素的影响，与活检的一致性不高，敏感性40% -60% ;HPV-DNA检测法：特异性低，约 20-40 %，约95 %的高危HPV-DNA感染者并不会发展成宫颈癌，无法确定病毒感染的真实致 癌性；临床急需一种检测速度快且灵敏度高的检测技术，更有利于患者的及时诊治。 实用新型内容 [0004] 为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于检测HPV感染细胞 产生E6、E7mRNA的试剂盒，可以快速、准确地检测HPV感染细胞产生的E6、E7mRNA。 [0005] 为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是：一种用于检测HPV感染细胞产 生E6、E7mRNA的试剂盒，包括盒体（1)、盒盖（2)和设置在盒体（1)内的衬垫（3)，所述衬垫 (3)上设有小孔，装有细胞透化溶液的试剂管（4)、装有杂交缓冲液的试剂管（5)、装有HPV 探针混合物的试剂管￠)、装有阳性标本的试剂管（7)、装有阴性标本的试剂管（8)被设置 在所述小孔内。
[0006] 根据本实用新型的实施例，所述试剂盒还包括：装有去离子水的试剂管（9)。
[0007] 根据本实用新型的实施例，所述衬垫（3)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫 (3)上分成2排平行排列。
[0008] 通过以上技术方案，本实用新型的有益效果如下：
[0009] 利用流式细胞仪设计抗体筛查宫颈癌，可节约检测时间和检测成本；尽早辨别具 有致癌风险的HR HPV感染人群，避免不必要的阴道镜和活检。




[0010] 图1为本实用新型的结构示意图；
[0011] 图2为使用本实用新型的试剂盒的阴性对照图；
[0012] 图3为使用本实用新型的试剂盒的阳性对照图；
[0013] 图4为检测某患者HPV感染细胞所得的E6、E7mRNA的试验结果；
[0014] 附图标记说明
[0015] 1-盒体、2-盒盖、3-衬垫、4-装有细胞透化溶液的试剂管、5-装有杂交缓冲液的试 剂管、6-装有HPV探针混合物的试剂管、7-装有阳性标本试剂管、8-装有阴性标本试剂管、 9-装有去离子水的试剂管。


[0016] 下面结合实施例对本实用新型的作进一步描述，本实用新型的优点 和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围 构成任何限制。
[0017] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0018] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0019] 如图1所示，本实用新型提供了一种用于检测HPV感染细胞产生E6、E7mRNA的试 剂盒，包括盒体1、盒盖2和设置在盒体1内的衬垫3,所述衬垫3上设有小孔，装有细胞透 化溶液的试剂管（4)、装有杂交缓冲液的试剂管（5)、装有HPV探针混合物的试剂管￠)、装 有阳性标本的试剂管（7)、装有阴性标本的试剂管（8)被设置在所述小孔内。
[0020] 其中，所述试剂盒还包括：装有去离子水的试剂管（9)。
[0021] 其中，所述衬垫（3)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫（3)上分成2排平行排 列。
[0022] 宫颈癌是高危性HPV持续感染，病毒整合到宿主细胞，致癌基因被激活，E6/E7编 码的原癌蛋白表达，E6、E7mRNA合成增加，肿瘤抑制因子pRB和P53失活，影响正常细胞 凋亡，细胞非典型发育异常，细胞癌变。该检测方法利用HPV E6E7探针检测细胞核中E6、 E7mRNA的表达量，其主要通过感染细胞数和感染细胞中E6、E7mRNA表达量来判断阳性、阴 性。HPV E6、E7mRNA阳性，一般提示CINII或CINIII，能有效帮助宫颈癌的筛查，能预测宫 颈癌的发生。
[0023] 本实用新型将标有荧光素的杂交探针与单细胞悬液在室温孵育，使荧光探针与胞 浆内E6/E7mRNA结合；单细胞悬液在鞘液的包裹下形成单细胞液流并流经检测窗口；仪器 产生的激光会激发抗体上标记的荧光素从而发出特定波长的光；仪器对不同波长的光进行 分别检测，并转换成电信号；电信号经计算机系统处理后可进行分析。
[0024] 检测步骤如下：
[0025] (1)仪器：流式细胞仪Accuri C6
[0026] (2)试剂：细胞透化溶液、缓冲液1、缓冲液2、杂交缓冲液、HPV探针混合物、洗液 1、洗液2均购置美国incell DX公司，PBS缓冲液购自北京中杉金桥生物技术有限公司
[0027] 操作步骤：
[0028] (1)取3个1. 5mlEP管，分别编号1号管、2号管、3号管，分别加入1ml (1*106细 胞）阳性细胞、阴性细胞、待检标本；
[0029] (2)细胞制备：将以上3管以800x g转速室温离心5分钟，去上清，然后加 lmlPBS (pH = 7. 4)，以800x g转速室温离心5分钟，去上清。
[0030] (3)细胞固定：将300 μ 1的细胞透化溶液加入待检样品管中（待检标本），轻轻 涡旋细胞1-2秒，在室温下孵育1小时；如果第一次离心样品如果没有可见的颗粒，应去除 上层，另加 lml样品，然后再离心。
[0031] (4)细胞杂交前准备：加 lml缓冲液1清洗细胞，轻轻涡悬1-2秒，以800xg转速 室温离心5分钟，去上清；轻轻涡旋残余液体中的细胞1-2秒，加 lml缓冲液2,轻轻涡悬细 胞1-2秒，以800x g转速室温离心5分钟，去上清，去除多的残余量，轻轻涡旋残余液体中 的细胞；将洗液1、洗液2放置在43°C水浴箱中，预热至少30分钟，再将其加到样本中。
[0032] (5)细胞杂交：在EP管加300 μ 1杂交缓冲液，9 μ 1HPV探针混合物，混合；将103L 的混合物加到标本管中，轻轻涡旋细胞；在43°C ± 1°C水浴中孵化30分钟。
[0033] (6)洗细胞：每个样品管加 lml预热的洗液1，轻轻涡旋细胞；以800x g转速室温 离心5分钟，去上清,轻轻涡旋残留细胞；每个样品管加 lml预热的洗液2,轻轻涡旋细胞， 放在43°C ± 1°C水浴中孵化30分钟，以800x g转速室温离心5分钟，去上清，轻轻涡旋残 留细胞。加100-400 μ 1 IX PBS (pH 7. 4)，细胞重悬，等待上机。
[0034] (7)上机分析：细胞每秒流速限制在200-800个/s，收集P1门内细胞至少25000。
[0035] 结果判定依据：
[0036] 如图 2所示，当出现P3 (HPV E6/E7mRNA 阳性细胞）彡 1. 7%且R1 (HPVE6/E7mRNA强 阳性细胞）<〇. 2%细胞群，表明结果为阴性；反之，如图3所示，当出现P3(HPV E6/E7mRNA 阳性细胞）>1.7%或R1(HPV E6/E7mRNA强阳性细胞）彡0. 2%细胞群，表明结果为阳性。
[0037] 如图4所示，某患者HPV感染细胞所得的E6、E7mRNA的试验结果：
[0038] P1门内细胞数（鳞状上皮细胞）1000个
[0039] HPV E6/E7mRNA 阳性细胞比例 P3 = 3. 3%
[0040] HPV E6/E7mRNA 强阳性细胞比例 R1 = 0· 5%
[0041] 结果：阳性
[0042] 上面已经举例说明了本实用新型的实施例，本领域技术人员应该理解的是，在不 偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替 换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。