专利名称：脱脂乳培养基在检测ⅱ类细菌素产生菌qs中的应用的制作方法群体感应(Quorum Sensing，QS)是指微生物群体某些基因的表达受到与群体密度相关的信号分子调控的现象。即细菌通过合成、分泌自诱导分子(autoinducer，Al)作为信号分子，并能感知其浓度变化，当Al浓度随着细菌群体密度达到一定阈值时，启动特异性基因表达，控相关的生物学功能，如菌体发光、抗生素的生物合成、毒性因子的产生、胞外多糖的合成、细菌丛集、生物膜形成、质粒接合转移、稳定生长期的进入等。近些年来，随着生活水平的提高，人们对食品安全的要求也越来越高。世界范围内的食品安全问题日益突出，每年因为食源性病菌导致人类疾病的事件也屡见不鲜。然而，大量使用化学防腐剂可能导致人体不同程度的副作用，比如诱癌、致畸和引起食物中毒等问题。因此，研究者越来越多地关注天然食品防腐剂。乳酸菌细菌素是由公认安全的乳酸菌在代谢过程中产生的一类蛋白类抗菌物质，是一类绿色、健康的天然生物防腐剂，主要对与其遗传关系相近的细菌具有杀菌或溶菌作用。乳酸菌产生的细菌素主要有四类，其中，II类细菌素为未经修饰的热稳定疏水性多肽，分子量小于lOKDa，不含羊毛硫氨酸。II类细菌素由于其抗菌谱广，稳定性好，可以弥补乳酸链球菌素(nisin)的一些不足，从而成为一类极具发展潜力的食品天然防腐剂。对细菌素的纯化、分子结构、特征、抑菌机理、应用等方面的研究已经进行的较为深入，但对其发酵调控方面的研究尚处于起步阶段。目前研究发现，群体感应机制是调控乳酸菌产生II类细菌素行为的重要机制。但已经发现的受群体感应机制调控的II类细菌素产生菌，多为偶然发现。其中，细菌素合成能力丧失的细胞表型的获得是关键。而细菌素合成能力丧失的细胞表型，一般是通过控制接种量及培养温度等因素来获得。但由于大多乳酸菌都采用MRS培养基，培养基中的牛肉膏、蛋白胨等氮源可能会充当自诱导肽的角色，进而干扰通过控制接种量、培养温度等途径对群体感应的认定，影响QS的研究。培养基的选择对群体感应调控现象的研究也有着非常重要的影响。Flynn等的研究发现唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivariussubsp.salivarius)UCC 118在麦芽汁培养中培养可获得不产细菌素的表型。由于很多乳酸菌都可以在脱脂乳培养基中生长，因此以脱脂乳培养基为研究对象无疑是一个不错的选择。虽然已发现许多产II类细菌素乳酸菌，但其细菌素的产生是否受到群体感应机制调控尚未形成一套有效的检测方法
本发明的一个目的是提供一种液体脱脂乳培养基的新用途。本发明所提供的新用途具体为液体脱脂乳培养基在检测或辅助检测待检细菌产生II类细菌素是否存在群体感应调控现象中的应用。所述液体脱脂乳培养基的溶质为脱脂乳，溶剂为水；所述脱脂乳与所述水的配比为8 12g比100ml, pH为6.5 7.0。本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待检细菌产生II类细菌素是否存在群体感应调控现象的方法。该方法包括如下步骤:先将具有产生II类细菌素能力的待检细菌悬浮在无菌生理盐水中(IO9CFUAiL)，接种于液体脱脂乳培养基中培养，在进入稳定期之前这一时间段中的任一时刻(上述培养体系此时不含有II类细菌素)，然后向所述液体脱脂乳培养基中添加自诱导物，继续培养至50-70h，如60h，得到培养物，检测所述培养物中是否存在所述II类细菌素，按照如下方法确定所述待检细菌II类细菌素的产生是否存在群体感应调控现象:若所述培养物中存在所述II类细菌素，则认为所述待检细菌II类细菌素的产生存在群体感应调控现象或候选存在群体感应调控现象；反之，则认为所述待检细菌II类细菌素的产生不存在群体感应调控现象或候选存在群体感应调控现象。所述自诱导物为将所述待检细菌在产生II类细菌素状态下进行液体发酵得到的发酵上清液。在本发明的一个实施例中，所述将具有产生所述II类细菌素能力的待检细菌接种于液体脱脂乳培养基中培养，在进入稳定期之前这一时间段中的任一时刻中，接种量为0.5% (体积比)，培养温度为37°C，培养时间为8-12h，或10 12h。以上为用于检测群体感应调控现象是否存在的培养物的前处理方式。所述液体脱脂乳培养基的溶质为脱脂乳，溶剂为水；所述脱脂乳与所述水的配比为 8 12g 比 100ml, pH 为 6.5 7.0。所述自诱导物是按照包括如下步骤的方法获得的:将具有产生II类细菌素能力的所述待检细菌接种于能使所述待检细菌产生II类细菌素的培养基中培养至稳定期，如稳定期末期(这时发酵液中自诱导物含量最高)，收集发酵上清液，得到所述自诱导物。`在本发明的实施例中，所述能使所述待检细菌产生II类细菌素的培养基为MRS培养基，如液体MRS培养基。实际操作中，所述自诱导物的获得方法具体可包括如下步骤:将所述待检细菌以体积百分比0.5 I %或体积百分比0.5 %的接种量接种到所述MRS培养基中，30 37°C培养20-24h，或37°C培养20-24h，或37°C培养24h后收集发酵上清液，得到所述自诱导物。所述液体MRS培养基的溶剂为水，溶质为蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、K2HPO4.3Η20、柠檬酸三铵、NaAC、葡萄糖、MgSO4.7H20、MnSO4.H2O和吐温80 ;所述水、所述蛋白胨、所述牛肉膏、所述酵母浸粉、所述K2HPO4.3H20、所述柠檬酸三铵、所述NaAC、所述葡萄糖、所述MgSO4.7Η20、所述MnSO4^H2O和所述吐温80 的配比为 100ml: IOg: IOg: 5g: 2g: 2g: 5g:20g: 0.58g: 0.25g: lmL，其 pH 为 6.5 7.0。所述方法中检测所述培养物中是否存在所述II类细菌素是通过检测所述培养物对指示菌的抑菌作用实现的，如果所述培养物对指示菌有抑菌作用，所述培养物中含有所述II类细菌素，如果所述培养物对指示菌无抑菌作用，所述培养物中不含有所述II类细菌素。所述指示菌为其生长能被所述待检细菌所产II类细菌素抑制的菌株，如植物乳杆菌(L.plantarum)PL2 (可被戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) 31-1 所产 II 类细菌素抑制)或单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 54002 (可被戍糖乳杆菌(L.pentosus)LPL1-5所产II类细菌素抑制)。在本发明的实施例中，检测所述培养物对所述指示菌的抑菌作用的方法具体可包括如下步骤:首先，将经过所述自诱导物诱导培养至50-70h，如60h的所述待检细菌培养物的上清液过滤除菌，收集液体并调整pH至6.5 7.0，得到待测液体。其次，取新鲜过夜培养的指示菌，用无菌生理盐水稀释至IO6 107CFU/mLjn 106CFU/mL，取Iml与冷却至45 55°C，如50°C的15 20ml MRS固体培养基混匀倒平板。待平板凝固后，放入牛津杯，分为处理组和对照组。处理组按照50 200 μ I/杯，如100 μ I/杯的用量，加入上述待测液体，对照组中不加入上述待测液体。37°C培养18 36h，如24h，观察抑菌效果。如果对照组无抑菌圈，而处理组出现抑菌圈，则所述培养物对所述指示菌有抑菌作用，如果对照组无抑菌圈，而处理组也未出现抑菌圈，则所述培养物对所述指示菌无抑菌作用。上述方法中的所述待检细菌为乳酸菌，如乳杆菌。在本发明的实施例中具体为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) 31-1 或戍糖乳杆菌(L.pentosus) LPL1-5本发明的再一个目的是提供一种获取具有不产II类细菌素细胞表型的II类细菌素产生菌细胞的方法。该方法包括如下步骤:将具有产生II类细菌素能力的待检细菌接种(接种量可小于等于0.5% )于液体脱脂乳培养基中培养即得到具有不产所述II类细菌素细胞表型的II类细菌素产生菌细胞。其中，不产所述II类细菌素的细胞表型是指所述具有产生II类细菌素能力的待检细菌的代谢物对指示菌无抑制生长作用的细胞表型。所述指示菌为其生长能被所述待检细菌所产II类细菌素抑制的菌株，如植物乳杆菌(L.plantarum) PL2 和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 54002。实际操作中，可利用包括如下步骤的方法获得所述具有不产II类细菌素细胞表型的II类细菌素产生菌:将II类细菌素产生菌以0.5% (II类细菌素产生菌悬浮于无菌生理盐水中，细胞密度为109CFU/mL)的接种量接种到所述液体脱脂乳培养基中，37°C培养。所述液体脱脂乳培养基的溶质为脱脂乳，溶剂为水；所述脱脂乳与所述水的配比为 8 12g (如 Hg)比 100ml。上述方法中的所述待检细菌为乳酸菌，如乳杆菌。在本发明的实施例中具体为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) 31-1 或戍糖乳杆菌(L.pentosus) LPL1-5本发明使得从II类细菌素产生菌中大规模高通量筛选受群体感应调控的菌株成为了可能，且本发明检测方法简便，成本低廉，不需要昂贵的仪器设备。另外，通过本发明所提供的方法获得的菌种可用于II类细菌素发酵的群体感应调控方面的研究。
图1为利用液体脱脂乳培养基检测或辅助检测待检细菌产生II类细菌素是否存在群体感应调控现象的流程图。图2为自诱导物诱导II类细菌素产生的抑 菌活性实验结果。其中，A实验组(经自诱导物诱导的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果)出为对照组I (用等量MRS液体培养基代替自诱导物诱导的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果)；C为对照组3(100μ IL.pentosus 31_160h培养物与自诱导物(5μ1/10ηι1)的混合物的抑菌效果)；D为对照组2(自诱导物的抑菌效果)。

.7.0,121°C灭菌 20min。固体MRS培养基:为MRS液体培养基加入15g/L琼脂粉。固体TSYE培养基:称取胰蛋白胨17g，大豆胨3g，酵母浸粉6g，NaCl 5g，K2HPO4.3Η20 2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15，溶于IOOmL蒸馏水中，pH6.5 7.0，121°C灭菌20mino实施例1、检测或辅助检测戊糖乳杆菌(L.pentosus) 31-1产生II类细菌素是否存在群体感应调控现象戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus) 31-1 为 II 类细菌素产生菌(GuorongLiuiYanni LviPinglan LiiKang Zhou，Jinglan Zhang.Pentocin 31-1,an ant1-Listeriabacteriocin produced by Lactobacillus pentosus 31-1 isolated from Xuan-WeiHam，a traditionalChina fermented meat product.Food Control，2008，19:353-359.Zhang Jinlan， Liu Guorong， Shang Nan， Cheng Wanpeng， Chen Shangwu, Li Pinglan.Purification and Partial Amino Acid Sequence of Pentocin 31-1,an Ant1-ListeriaBacteriocin Produced by Lactobacillus pentosus 31-1.Journal of FoodProtection, Volume 72,Number 12.2524-2529.) 本实施例将详述如何利用本发明的方法检测或辅助检测戊糖乳杆菌(L.pentosus) 31-1产生II类细菌素是否存在群体感应调控现象(实验流程如图1所示)。具体按照如下步骤进行:1、制备自诱导物(发酵上清液)将悬浮于无菌生理盐水(109cfu/ml)中的戊糖乳杆菌(L.pentosus) 31-1以0.5% (体积比)的接种量接种到液体MRS培养基中，37°C培养24h(戊糖乳杆菌(L.pentosus) 31-1处于稳定期末期)，13800 Xg离心5min，收集发酵上清液，作为自诱导物。2、获得具有不产II类细菌素细胞表型的L.pentosus 31-1
将悬浮于无菌生理盐水(109cfu/ml)中的L.pentosus 31-1以0.5% (体积比)的接种量分别接种到液体脱脂乳培养基(同时设置如下四种液体培养基作为液体脱脂乳培养基的对照:液体MRS培养基、液体1/2MRS培养基、液体1/5MRS培养基和液体1/10MRS培养基)中，并在37°C条件下培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后，分别检测此时五种液体培养基的培养物中是否存在II类细菌素。具体方法为:分别收集不同培养时间的五种液体培养基的培养物，13800 X g离心5min，取上清液过滤除菌，调节pH至6.5 7.0，取100 μ I备用。以可被所述待检细菌所产II类细菌素抑制生长的植物乳杆菌(L.plantarum)PL2为指示菌用杯碟法测定上述不同培养时间的五种液体培养基培养物上清液的抑菌活性，从而判定所述培养物中是否含有II类细菌素。具体操作为:取过夜培养的新鲜指示菌植物乳杆菌(L.plantarum) PL2，用无菌生理盐水稀释至106CFU/mL，取Iml与冷却至50°C的20ml的MRS固体培养基混匀倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入经上述处理的上清液，37°C培养24h，观察抑菌效果。结果显示，经过72h培养，加入了液体脱脂乳培养基培养物上清液的平板仍未产生抑菌圈，而加入作为对照的四种液体培养基(MRS培养基、1/2MRS培养基、1/5MRS培养基和1/10MRS培养基)平板均产生抑菌圈(表I)。这一结果表明，包括对照培养基在内的共五种培养基中，只有所述液体脱脂乳培养 基的培养物上清液中不存在II类细菌素，进而说明利用所述液体脱脂乳培养基获得了不产II类细菌素细胞表型的L.pentosus 31_1。表I不同培养基对L.pentosus 31-1合成II类细菌素的影响


本发明公开了一种液体脱脂乳培养基的新用途。该新用途为在检测或辅助检测待检细菌产生II类细菌素是否存在群体感应调控现象中的应用。在所述应用中，先将具有产生II类细菌素能力的待检细菌接种于液体脱脂乳培养基中培养，在进入稳定期之前这一时段的任一时刻，然后向所述脱脂乳培养基中添加自诱导物，继续培养至50-70h，得到培养物，检测所述培养物中是否存在II类细菌素；若所述培养物中存在II类细菌素，则所述待检细菌产生II类细菌素存在或候选群体感应调控现象；反之，则所述待检细菌产生II类细菌素不存在或候选不存在群体感应调控现象。本发明使得从II类细菌素产生菌中大规模高通量筛选受群体感应调控的菌株成为了可能，且方法简便，成本低廉。