细胞培养生物成套生产装置制造方法 [0002] 动物细胞培养，是细胞源人用疫苗和细胞源动物用疫苗、抗体药物以及部分重组 蛋白药物的基础。单位体积培养增殖的细胞数量，是上述产物产量基础。尽力提高动物细 胞培养密度，为进一步的产品增产提供更有利条件，始终是上述产物产业化、工程化关注的 焦点。 [0003] 动物细胞培养，更多的是贴壁依赖细胞的培养，即细胞必须附着在一个适宜的表 面上生长、代谢和增殖。 [0004] 为给细胞提供生长的附着面，最初是将细胞和培养液置于方瓶中，方瓶平放，一个 较大的侧面在下，细胞就在这个侧面上生长。瓶子本身就小，利用量就很有限；瓶子6个面 只有一个面被利用，显然利用率很低。 [0005] 后来，将细胞和培养液置于圆柱形瓶子（转瓶）中，转瓶横放，下部部分瓶壁浸于 培养液中。转瓶缓慢旋转，贴附于瓶内壁的细胞周期性浸润到培养液中，离开培养液后，在 转瓶上部仍由培养液液膜提供营养。所以转瓶的瓶身内壁都成为细胞生长面。单位容积所 提供的细胞生长面比用方瓶增加了 一个数量级。 [0006] 转瓶培养的缺点是占地面积大、劳动强度高。 [0007] 1980年代发展出细胞培养生物反应器，即细胞培养罐。生物反应器内装培养液中， 加入若干微载体，微载体表面即是细胞生长面。微载体以美国GE的Cytodex系列及美国 NBS的DISK为两种典型微载体代表。Cytodex系列葡聚糖球形微载体，DISK为小塑料片支 撑的纸质微载体。Cytodex系列提供的比表面积更大，可以达到6000 (cm) 2/g。1克Cytodex I微载体约相当于2个IOL的转瓶提供的生长面。球形微载体更容易实现放大生产。除了 Cytodex外，球形微载体还有明胶微载体、琼脂糖微载体、壳聚糖微载体等，主要是选用生物 相容性更好的原材料来制造微载体。
[0008] 动物细胞，基本上都是好氧生长代谢，而且只能利用溶解于培养液的溶解氧。氧在 培养液中的饱和溶解度很低，37°c，常压下只有约3?5mg/L培养液。所以溶解氧是细胞生 长代谢的限制因素，供氧能力是细胞培养生物反应器的限制因素。
[0009] 现有技术中，采用的反应装置如图1所示的通气搅拌式细胞培养生物反应器、图2 所示的湍动床式细胞培养生物反应器、图3所示的气升式细胞培养生物反应器。现有细胞 培养生物反应器用于细胞培养时，可达到的最大细胞密度尚低。 实用新型内容
[0010] 本实用新型所要解决的技术问题是采用现有技术中的细胞培养生物反应装置进 行细胞培养时，生物反应器中可达到的最大细胞密度低的问题。提供一种新的细胞培养生 物成套生产装置，其具有生物反应器中可达到的最大细胞密度高的优点。
[0011] 为解决上述技术问题，本实用新型的技术方案如下：细胞培养生物成套生产装置， 包括细胞培养生物反应器、培养液增氧塔13 ;
[0012] 所述反应器具有反应器进料口 1、反应器取样口 2、反应器接种口 4、反应器排气口 6、pH检测装置和溶解氧检测装置；
[0013] 所述增氧塔13内部具有如下布置：上部空间设置液体分布器14、下部设置有与增 氧气体入口相连通的增氧塔气体分布器16,液体分布器14和增氧塔气体分布器16之间设 置填料层15 ;所述增氧塔顶部具有增氧塔尾气排放口 12 ;
[0014] 所述成套生产装置具有从所述反应器内取出液体物料并输送至所述增氧塔顶部 与液体分布器14相通的增氧塔进料通道I ;
[0015] 所述成套生产装置具有从所述增氧塔底部取出液体物料并输回所述反应器的液 体物料回输通道II。
[0016] 所述增氧气是指可以提供需氧细胞培养所需氧气的任何气体，例如纯氧、空气、氮 气氧气混合物、氧气二氧化碳混合物，氧气氮气二氧化碳混合物等等。优先使用空气与二氧 化碳混合气体。
[0017] 通道I和通道II采用的输送动力的来源和种类没有特别要求，在本实用新型说明 书记载的基础上本领域技术人员能够合理选择。例如通道I和通道II之一可以采用反应 器和增氧塔的位置高低使得其中一个通道通过液位差提供输送动力，而另一个通道的输送 动力需要借助于输送泵或压力罐或真空泵。例如通过调高增氧塔的高度或者调低反应器的 高度的方法可以实现通道II的输送动力来自液位差，而通道I借助输送泵；或者通过调低 增氧塔的高度或者调高反应器的高度的方法可以实现通道I的输送动力来自液位差，而通 道II借助输送泵。还可以通道I和通道II均采用输送泵等提供输送动力。本实用新型装 置的放料口没有特别限制，可以设置在反应器（例如反应器的放料口 5)，也可以设置在通 道I，当通道I设置输送泵时可将放料口设置在邻近输送泵的出口端（例如图4?9所示装 置的放料口 11)。
[0018] 作为本实用新型的优选方案之一，所述通道I设置输送泵10。
[0019] 上述技术方案中，优选所述通道I在所述反应器和输送泵10之间设置细胞分离器 17,所述细胞分离器为固液分离器，所述固液分离器的进料口与通道I的近反应器方向相 接；所述固液分离器具有轻物料输出口和重物料输出口，所述轻物料输出口与输送泵10的 进料口连接，所述重物料输出口输回所述反应器。
[0020] 所述的固液分离器没有特别限制，例如可以采用旋液分离器，也可以采用沉降器 等。所述的沉降器可以用斜管沉降器，此时固液分离器的进料口和重物料输出口合并为共 用口并与通道I的近反应器方向相接。斜管沉降器可以是具有或者不具有扩张管的斜管沉 降器，但为达到更好的分离目的优先采用有扩张管的斜管沉降器。所述轻物料也即是贫含 细胞的物料，所述重物料也即是富含细胞的物料。
[0021] 上述技术方案中，优选所述通道I在输送泵10和增氧塔13之间设置细胞碎片分 离器18。本实用新型装置在细胞培养过程中，借此细胞碎片分离器18将培养过程中产生的 细胞碎片从液态物料中除去，净化生物反应器的培养环境。
[0022] 上述技术方案中，所述反应器自身可以不带混合机构。
[0023] 上述技术方案中，所述的反应器自身可以带有混合机构。所述混合机构包括但不 限于搅拌桨混合机构、气升式混合机构，湍动式混合机构。例如所述的反应器为搅拌式反应 器；再例如所述的反应器为具有从反应器的底部进行通气的细胞培养搅拌式生物反应器； 再例如所述的反应器为湍动床式细胞培养生物反应器或气升式细胞培养生物反应器等等。
[0024] 上述技术方案中，对增氧塔内的填料层15中填料的材质和形状没有特别限制，均 可以采用现有技术中已有的那些。例如可选填料的材质可以为但不限于316L不锈钢、高硼 玻璃、聚四氟乙烯；填料的形状可以是但不限于波纹板、丝网、鞍状、拉西环、泡罩板、筛板、 纤维堆积体等。
[0025] 本领域技术人员知道，在通道I和/或通道II使用输送泵的场合，为了降低在细 胞培养过程中流量的波动，从而有利于培养过程更平稳地运行，还可以在相应的通道中设 置中间槽，使中间槽与输送泵的入口相连通；本领域技术人员还知道，为了提高增氧塔的生 产负荷，还可以为增氧塔自身建立循环回路。为了更方便监测细胞培养过程中反应器内的 培养液的温度，还可以在反应器上设置温度电极，从而有利于调节反应器内培养液的温度； 为监测装置运行过程中装置内由于液体与气体混合造成的泡沫情况，还可以在在生物反应 器设置消泡电极，从而有利于通过适时加入适量的消泡剂将装置内的泡沫控制在较小的 范围内；为了更方便监测细胞培养过程中反应器内的压力，还可以在反应器上设置压力表； 为了将反应器中所有物料排空，可以采用多种方法实现，但为了更加方便地进行排空操作， 可以设置专门用于排空物料的物料排空口，从而能够将反应器最底部的物料排空，而反应 器上的物料排空口的位置也没有特别要求，例如可以设置在反应器顶部而通过管道直达反 应器内的最底部物料，当然还可以把物料排空口设置在反应器的最底部位置；等等。
[0026] 本实用新型实施例和比较例中，使用了 pH检测装置和溶解氧电极等，但未在相应 的说明书附图中标出。
[0027] 本实用新型中
[0028] 本实用新型装置对细胞的种类没有特别限制，只要是培养过程中消耗氧的那些细 胞均可以采用本实用新型装置进行培养，均具有可比的技术效果。例如但不限于动物细胞， 动物细胞中例如但不限于CHO细胞、Vero细胞、BHK细胞、293细胞、二倍体细胞、SP20细胞、 淋巴细胞、地鼠肾细胞、猪睾丸细胞等。
[0029] 实验表明，采用本实用新型装置后，由于增氧的地点全部或者部分在增氧塔进行， 消除（当仅在增氧塔增氧不在反应器增氧时）或减少（当同时在增氧塔增氧和反应器增氧 时）了增氧过程中气泡对细胞的物理伤害，从而更有利于细胞的繁殖，提高了反应器中细 胞密度；当本实用新型装置进一步包括细胞分离器17时，使生物反应器中细胞密度得到进 一步提高；当本实用新型装置同时包括，采用细胞分离器17和细胞碎片分离器18时，生物 反应器中细胞密度得到更进一步提高。
[0030] 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本实用新型进行详细的说明。




[0031] 图1为现有通气搅拌式细胞培养生物反应器。
[0032] 图2为现有湍动床式细胞培养生物反应器。
[0033] 图3为现有气升式细胞培养生物反应器。
[0034] 图4为本实用新型第一种实施方式示意图；其中的反应器自身具有搅拌桨，但反 应器自身没有通气装置。
[0035] 图5为本实用新型第二种实施方式示意图；其中的反应器自身具有搅拌桨，但反 应器自身没有通气装置。通道I设置细胞分离器17 (以具有扩张管的斜管沉降器为例）。
[0036] 图6为本实用新型第三种实施方式示意图；其中的反应器自身具有搅拌桨，但反 应器自身没有通气装置。通道I设置细胞分离器（以具有扩张管的斜管沉降器为例）、输送 泵和细胞碎片分离器18 (以旋液分离器为例）。
[0037] 图7为本实用新型第四种实施方式示意图；与图6的区别仅仅是采用的反应器为 图1所示的现有具有用于从反应器的底部进行通气的搅拌式细胞培养生物反应器。
[0038] 图8为本实用新型第五种实施方式示意图；与图6的区别是采用的反应器为图2 所示的现有湍动床式细胞培养生物反应器。
[0039] 图9为本实用新型第六种实施方式示意图。与图6的区别是采用的反应器为图3 所示的现有气升式细胞培养生物反应器。
[0040] 图10是实施例1的培养时间与反应器中细胞密度关系曲线。
[0041] 图11是实施例2的培养时间与反应器中细胞密度关系曲线。
[0042] 图12是实施例3的培养时间与反应器中细胞密度关系曲线。
[0043] 图13是比较例1的培养时间与反应器中细胞密度关系曲线。
[0044] 图14是比较例2的培养时间与反应器中细胞密度关系曲线。
[0045] 图1?9中，1为反应器进料口，2是反应器取样口，3为反应器的搅拌桨，4为反应 器的接种口，5为反应器的放料口，6为反应器排气口，7为反应器内气体分布器，8为反应器 的多孔板，9为上下开口的导流筒，10为通道I上设置的输送泵；11为本实用新型装置的放 料口；12为增氧塔尾气排放口，13为增氧塔，14为液体分布器，15为填料层，16为增氧塔内 部的气体分布器；17为细胞分离器（以具有扩张管的斜管沉降器为例），18为细胞碎片分 离器（以旋液分离器为例）。图1?9的反应器中还设置了 pH检测装置和溶解氧检测装 置，但未在图中示出。

【具体实施方式】
[0046] 【实施例1】
[0047] -、实验装置
[0048] 采用图4所示的成套生产装置，其中
[0049] 5L生物反应器（工作体积3. 5L)及控制柜：瑞士比欧公司；
[0050] 增氧塔：自制
[0051] 增氧塔塔体为外径200mm、壁厚5mm的玻璃管，高度450mm，填料为直径为5mm的高 硼硅酸盐玻璃球，填料层高度为250mm。
[0052] 二、实验材料
[0053] Vero细胞：来自中国科学院上海细胞库；
[0054] 微载体cytodex I :美国GE公司；
[0055] 基础培养基M199 (不含NaHCO3):美国Hyclone公司；
[0056] M199基础培养液：将9. 45重量份的基础培养基M199加900重量份注射用水溶解， 然后用浓度为5w%的碳酸氢钠水溶液调节pH为7. 20?7. 30,再用注射用水稀释到1000 重量份，除菌过滤，即得M199基础培养液，待用；
[0057] 新生牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；
[0058] 完全培养液：按照体积比计，M199基础培养液：新生牛血清=90:10混合；
[0059] 消化液：将0. 25重量份的胰蛋白酶和0. 02重量份的EDTA - 2Na溶解于100重量 份的生理盐水中得到；
[0060] 生理盐水：0· 85w% NaCl的注射用水溶液；
[0061] 增氧气体：空气与二氧化碳的混合物，其中空气与二氧化碳体积比为95:5。
[0062] 三、操作方法
[0063] 1、细胞准备
[0064] I. 1细胞消化分散
[0065] 倾去培养有Vero细胞的转瓶中的培养液，用生理盐水洗涤掉瓶子残余培养液，洁 净室内温度（22?26°C )下，每个转瓶加500ml消化液进行消化，目测瓶壁上细胞开始收 缩时，弃去消化液，每个转瓶用500ml生理盐水洗涤一次，洗去残留消化液。加入完全营养 液，吹打，计数，得到的细胞悬液用于下述步骤1. 2贴壁。
[0066] L 2 贴壁
[0067] 称取140g(Cytodex I)微载体用8000ml生理盐水浸泡溶胀过夜，再121°C灭菌30 分钟。降至室温，弃上层清液，然后用微载体视体积2倍的完全培养液换洗3次，待用。
[0068] 取I. 1中得到的含7. 50 X IO8个细胞/ml的悬液250ml和含140g微载体的完全 培养液加入到移种瓶，加完全培养液至8000ml，放入36. 8°C ±0. 2°C二氧化碳培养箱中（培 养箱中的气氛为空气与二氧化碳混合物，空气与二氧化碳的体积比为95:5)，每隔15分钟 轻轻晃动移种瓶，使细胞和微载体充分接触，以利细胞在微载体均匀贴壁。重复4次。然后 继续在所述培养箱中培养4小时，得到微载体贴壁细胞。倒掉部分培养液，保留微载体贴壁 细胞，剩余至体积3000ml刻度，作为移种混合液，备用。
[0069] 2、生产装置准备
[0070] 2. 1、经反应器进料口 1向反应器中注入浓度为20mmol/L、pH = 7. 20的磷酸盐缓 冲液3500毫升，灭菌，待用；
[0071] 2. 2、将图4中所用器材经灭菌后，按图4在无菌条件下连接。
[0072] 2. 3、将反应器内物料降至36. 8°C ±0. 2°C，校准溶解氧电极的溶解氧浓度显示为 0%〇
[0073] 2. 4、排空生物反应器内的磷酸盐缓冲液。
[0074] 2. 5、边注入完全培养液，边开启输送泵10,控制培养液进入增氧塔的流速为 500ml/分钟，使生物反应器内液面稳定在2L刻度处。同时通过增氧塔的气体分布器连续向 增氧塔通入无菌增氧气体，无菌增氧气体向上通过填料层15然后从增氧塔排气口 12排出； 直至培养液在反应器和增氧塔之间达到稳定循环，控制生物反应器搅拌为30转/分；控制 生物反应器温度为36. 8 °C ±0. 2 °C ;控制生物反应器中液体的pH为7. 20?7. 30, pH调节 剂是浓度为5w %的碳酸氢钠水溶液，并且溶解氧电极显示走平。
[0075] 2. 6、校准溶解氧电极溶解氧浓度显示为100%。
[0076] 3、细胞培养和取样分析
[0077] 3. 1、排空生物反应器内的完全培养液。经接种口 4将步骤1. 2获得的移种混合液 转接到生物反应器，经进料口 1补充完全培养液至反应器内液面在3. 5L刻度处，然后维持 以5. 85升/小时的速度从进料口 1连续补充完全培养液，同时从放料口 11连续取出培养 液以维持反应器内的液面高度为3. 5L处不变，通过调节增氧气体流速控制生物反应器溶 氧浓度不低于40%，并开始培养计时。
[0078] 3. 2、取样和分析
[0079] 从反应器的取样口 2定时取样1ml，弃去上层清液，样品沉积物用IOml生理盐水洗 涤一次，再以1000转/分钟离心处理，弃上清液。沉积物用10毫升消化液消化，将贴壁于 微载体的细胞消化下来。用生理盐水稀释后用血球计数板对细胞计数，换算出相应时刻的 生物反应器中的细胞密度。
[0080] 表1给出了实施例1的培养时间和生物反应器中的细胞密度。为便于直观考察培 养时间和细胞密度的关系，根据表1的数据绘制了图10。从图10可以看出，培养96小时时 达到了细胞密度的最大值I. 50X IO8个/毫升。96小时后细胞处在平衡期并出现细胞少量 衰亡。
[0081] 表 1