沼水蛙抗菌肽及其应用的制作方法[0002]抗菌肽由于其广谱抗菌活性和特殊的抑菌机制使其具有重要的理论研究和药物开发应用价值。两栖动物皮肤能够分泌大量的抗菌肽来抵御外来微生物的侵袭，自研究者从非洲爪蟾皮肤分泌物中发现第一个两栖动物抗菌肽magainins开始，已经有上千种抗菌肽从两栖动物皮肤分泌物中通过分离纯化或基因克隆方法得到，这些抗菌肽一般由10-50个氨基酸构成。根据抗菌肽的氨基酸序列将其分成100多个不同的家族，这些不同家族的抗菌肽在分子量大小、电荷、疏水性、结构和功能上都不相同。通过对这些抗菌肽的结构和功能的研究，不仅得到了许多具有广谱高效的杀菌作用的多肽，而且还改进了许多天然抗菌肽。[0003]不同来源的两栖动物抗菌肽在氨基酸组成和序列上存在显著差异，根据二级结构特征可以将其分为α-螺旋抗菌肽，β-折叠抗菌肽，无规卷曲抗菌肽和扩展型抗菌肽。研究者通过圆二色谱研究发现，许多抗菌肽，如来源于Iaevis的Magainin2,来源于Rana nigromaculata的temporin-lRNa、temporin-lRNb等在抗菌妝在模拟细胞膜环境下会自发折叠成两亲性的α-螺旋结构。这些抗菌肽通过静电相互作用与细菌细胞膜上的磷脂双层结合，在细胞膜环境下折叠成两亲性的α-螺旋结构，从而破坏细胞膜完整性，造成细胞内容物溶出而导致细胞死亡。随着对抗菌肽结构与功能关系的深入研究，抗菌肽的医学价值越发明显，被研 究者称为“多肽抗生素”。目前开发抗菌活性强，毒副作用小，结构简单的抗菌肽已成为一个紧迫的任务。[0004]沼水娃(Jfylarana guentheri)是中国南部地区常见两栖动物,其皮肤分泌物中含有多种抗菌肽。有研究表明，蛙科动物至少需要20-30种抗菌肽才能形成较好的抗菌屏障，而目前已报道的沼水娃抗菌肽有9个,分别属于brevinin、temporin和guentherin家族，仍然有许多沼水蛙皮肤抗菌肽未被发现。沼水蛙皮肤抗菌肽的分离纯化和抗菌活性研究还需要进一步的加强。
[0005]本发明目的是提供两种制备简单，抑菌活性强的沼水蛙抗菌肽，并且可以将该抗菌肽应用于抗菌类药物的研制与开发。[0006]一种沼水蛙抗菌肽，所述抗菌肽A由29个氨基酸构成，序列为SEQ ID N0.1:FLQHIIGALSKIFLVSIDKVRCKVAGGCN, C端的两个半胱氨酸形成一对二硫键。[0007]一种沼水蛙抗菌肽，所述抗菌肽B由18个氨基酸构成，序列为SEQ ID N0.2:FFPLIFGALSKILPKIFL, C 末端酰胺化。
[0008]本发明所述抗菌肽包括与SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所述抗菌肽具有80%或以上同源性的多肽，该多肽功能与SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所述抗菌肽相同或相似。[0009]本发明的另一个目的是提供一种多肽片段，包括序列为SEQ ID N0.1或SEQIDN0.2的多肽或同源性多肽。该多肽片段与序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2的抗菌肽功能相同或相似。
[0010]所述抗菌肽A具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有强抑制作用，而抗菌肽B对革兰氏阳性菌效果突出。与其最小抑菌浓度相比，抗菌肽A和B的溶血性均比较低，表明它们在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。上述抗菌肽对细菌的抑制作用见实施例3，溶血活性结果见实施例4。 [0011]本发明所述抗菌肽在疏水环境中形成α-螺旋结构。利用圆二色谱(CD)测定抗菌肽在不同浓度三氟乙醇(2，2，2-Triflu0r0ethan0l，TFE，模拟细胞膜疏水环境)中的二级结构，结果表明抗菌肽A和B的α -螺旋结构含量随着TFE浓度提高而增加。该结构特征对研究抗菌肽的抑菌机理有重要意义。
[0012]本发明所述抗菌肽的螺旋轮状图分析可知，该抗菌肽的疏水面或者亲水面对应氨基酸替换、缺失或修饰得到的抗菌肽A或B的类似物都可能与原抗菌肽具有相同或相似的活性。
[0013]鉴于上述抗菌肽的性质和功能，本领域普通技术人员可以以该抗菌肽为模板，通过改变该抗菌肽的序列对沼水蛙抗菌肽定向改造或合成其衍生物以提高其抗菌活性，用于药物研发和临床治疗。



[0014]图1:沼水蛙皮肤分泌物S印hedex G_50凝胶过滤色谱图。
[0015]图2:凝胶过滤色谱分离组分峰I和峰2对大肠杆菌(A)和金黄色葡萄球菌(B)的抑制作用。
[0016]图3:凝胶色谱洗脱峰峰I的反相高效液相色谱图。
[0017]图4:沼水蛙抗菌肽A和B在不同浓度TFE溶液中的圆二色谱。
[0018]图5:沼水蛙抗菌肽A的螺旋轮状图(A)和抗菌肽B的螺旋轮状图(B)。

[0019]本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施例。
[0020]实施例1
本发明所述抗菌肽的分离纯化包括Sephadex G_50凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱(RP-HPLC)两个步骤。
[0021]提取沼水蛙皮肤分泌物:成年沼水蛙，去离子水洗净，市售9 V直流电池电击沼水蛙耳后腺及背部腺体发达部分皮肤，待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，用含0.05%(K/K)三氟乙酸的去离子水冲洗并收集分泌物，12 000 rpm离心15 min，取上清液冷冻干燥，-80 °C低温保存。
[0022]Sephadex G_50凝胶过滤色谱:按上述方法获得沼水蛙皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，12 000 rpm离心15 min。取上清液用0.22 μ m孔径微滤膜过滤后，上样到用去离子水平衡的Sephadex 6_50凝胶柱(1.6 cmX 100 cm)。用去离子水洗脱,流速0.3 mL/min，于214 nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，得到两个洗脱峰峰I和峰2，如图1所示。收集洗脱峰，冷冻干燥，进行抗菌活性测定。
[0023]反向高效液相色谱:去离子水溶解上述峰I冻干粉，采用反相高效液相色谱进一步分离。液相色谱系统为LC-20A,装配Gemini 5 μ C18 (250 mmX 10 mm)反相柱(Phenomenex, UK)，用含0.05% (K/K)的三氟乙酸的水和乙腈溶液构成的洗脱系统进行梯度洗脱。洗脱梯度:0~5 min，O~20%乙腈；5~40 min, 20%~70%乙腈；洗脱流速1.0mL/min，检测波长214 nm，洗脱曲线如图3所示。收集所有洗脱峰，测定抗菌活性。
[0024]收集具有较强抗菌活性的组分，冷冻干燥，，用自动氨基酸测序仪测序，得到抗菌肽 A (SEQ ID:N0.1)和抗菌肽 B 的序列(SEQ ID:N0.2)。
[0025]实施例2
琼脂涂布法检测凝胶过滤色谱分离组分的抑菌活性:
所用菌种大肠杆菌(Escherichia coli ATCC8099)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003)为本室保存。具体操作如下:选取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，过夜振摇培养(37 °C, 130 rpm)，将200 μ L过夜培养菌液接种于20 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中,振摇培养4小时。培养好的菌悬液稀释I 000倍,取100 μ L加入平板培养基表面，涂布均匀。在涂布好菌液的平板培养基表面均匀地贴上直径为5 mm的圆形滤纸片，每个滤纸片上加10 μ L待测样品。庆大霉素作为阳性对照，无菌水做阴性对照。将加完样品的平板倒置于37 °C恒温培养箱中培养18~20 h，实验结果如图2所示。添加庆大霉素(标记为“ + ”)和S印hadex G_50凝胶色谱分离组分Fl的样品(标记为“I”)的滤纸片周围出现明显的抑菌圈，而加无菌水(标记为“一”)和S印hadex G-50凝胶色谱分离组分F2的样品(标记为“2”)的滤纸片周围细菌正常生长，表明S印hadex G_50凝胶色谱组分Fl对大肠杆菌(图2A)和金黄色葡萄球菌(图2B)都有明显的抑制作用，采用高效液相色谱进一步分离。
[0026]实施例3
利用液体生长抑制法检测本发明所述多肽对细菌的抑制活力:
本实施例所用抗菌肽由上海吉尔生化有限公司根据序列SEQ ID N0.1和序列SEQ IDN0.2合成，合成的抗菌肽保持原有的修饰，其中抗菌肽A的C端半胱氨酸形成二硫键，抗菌肽B的C端酰胺化。两个合成肽纯度均不小于95%。采用96孔板法测定样品最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),具体操作如下:
菌种复苏，接种斜面37 °C培养过夜，挑单菌落接种于普通LB培养基中，37 °C培养过夜，稀释菌液使菌浓度为IO4-1O5 CFU/mL,按每孔100 μ L菌液接种于96孔板中，加入10μ L以一定比例稀释后的多肽，将96孔板置于37 °C过夜培养，用酶标仪检测630 nm波长的吸光值，结果见表一。
[0027]含有抗菌肽的细菌生长浓度(OD63tl)与不加抗菌肽的细菌生长浓度的比值大于90%时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(定义为显著抑制细菌生长的最低浓度)。
[0028]由检测结果可知，抗菌肽A和抗菌肽B对常见的细菌的最小抑菌浓度均达到微克级，具有极强的抑菌活力。抗菌肽B对革兰氏阳性菌的杀灭作用尤为明显。
[0029]表一:沼水蛙抗菌肽的最小抑菌浓度