专利名称：副溶血性弧菌双重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌，是沿海国 家的重要食物中毒致病菌之一，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反 应。副溶血性弧菌主要存在于海水及海产品中，在日本由该菌引起的食物中毒占细菌性食 物中毒的40% 60%，位居首位。另外，美国、澳大利亚、英国、比利时、法国、韩国和东南亚 地区，都有该菌引起食物中毒爆发的报告。我国从1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引 发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，均已超过沙门氏菌食物中毒， 跃居细菌性中毒的首位。副溶血性弧菌传统的检测方法是基于形态特征、染色特征、生化特征、血清分型等 表型特征来鉴定。这些常规的方法在副溶血性弧菌研究工作中起到了重要作用，但现代科 学技术的发展，传统的依靠表型特征来鉴定副溶血性弧菌的方法，已远远不能满足对该菌 的快速诊断以及流行病学研究的需要，暴露出许多不足之处操作繁琐，鉴定周期长，不利 于急性中毒的快速诊断和口岸快速通关的要求；副溶血性弧菌的致病机理复杂且多样化， 不含毒力因子的菌株不一定致病，而传统的培养鉴定法短时间内无法确定该菌的毒力强 弱，还需继续增加其他特殊的生化等鉴定实验，这无疑使鉴定周期更加漫长。因此，迫切急 需研究出能够更加快速、准确无误、检测通量更高、人为影响因素尽可能减少，而且能获得 分离的病原体基因型别、毒力基因分布等多重信息的检测方法。用于副溶血性弧菌分子检测比较常见的主要有常规PCR、单一实时荧光PCR以及 基因芯片等。虽然，常规PCR具有高灵敏度、操作简单等优点，但是需要对产物进行后处理， 容易污染，同时，染色剂、紫外光等对操作人员身体健康有威胁，不易自动化和标准化；基因 芯片技术具有高特异性、高通量等优点，但是需要先扩增再杂交，技术还不是很稳定，尤其 是仪器设备昂贵，不利于推广应用。实时荧光PCR技术充分结合了 PCR扩增和探针杂交的 优势，具有高灵敏度、高特异性，重复性和稳定性良好的优点，一次上机即可完成结果检测， 容易自动化。实时荧光PCR技术根据荧光能量传递原理，融合了 PCR技术的高效扩增、探针技术 的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确性等优点。它是利用荧光信号伴随着PCR产物 的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光光信号的变化。 根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99. 7%的置信度时计算出大于平均值的荧光 信号即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和 PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始 模板拷贝数。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序 列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引 物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。目前副溶血性弧菌的荧光PCR检测上，文献报道以gyrase为目的基因就无法区分 副溶血性弧菌和溶藻弧菌，tlh和tdh为靶基因容易出现假阳性结果。副溶血性弧菌在我 妻氏琼脂上引起β-溶血，称为神奈川现(KP现象)。KP现象是鉴定副溶血性弧菌致病性 和非致病性菌株的一项重要指标，其主要是热稳定性溶血素tdh基因引起，tdh基因是副溶 血性弧菌的主要毒力因子，具有致死毒性、心脏毒性、细胞毒性和肠毒素作用。最近的研究 还表明，tdh基因家族也广泛存在于人类致病性弧菌中，如部分霍利斯弧菌(V.hollisae)， 某些拟态弧菌菌株中也有tdh基因，非01群霍乱弧菌中也存在同源性约为93% 96%的 tdh相关基因。因此，以单独以tdh基因为目标基因就无法准确鉴定出副溶血性弧菌。在单一荧光PCR基础上的多重实时荧光PCR方法，可针对多个基团为目的基因进 行检测。多重实时荧光PCR法用于病原菌的检测，无论在国内还是在国外都刚刚起步，目前 尚无副溶血性弧菌的多重实时荧光PCR的检测试剂盒问世。
本发明的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度高、特异性强的副溶血性弧菌双重实 时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次反应就能完成副溶血性弧菌 的特异性检测和毒力基因检测。本发明利用双重实时荧光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作为 靶基因，toxR基因用于特异性检测副溶血性弧菌，tdh基因用于检测是否携带毒力基因，优 化设计引物、探针和反应条件，使得在一次扩增反应中对副溶血性弧菌进行特异性检测的 同时检测其毒力基因，达到简便、快速、准确可靠和安全的目的，从而实现了本发明的目的。本发明的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引 物如下所示针对toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 1 所示)5:CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；(如 SEQ ID N0. 2 所示)针对tdh 基因5~ -GGCTGACATCCTACATGACTG-3“；(如 SEQ ID N0. 3 所示)5~-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3、；(如 SEQ ID N0. 4 所示)本发明的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探 针如下所示toxR 基因的探针5~-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3、；(如 SEQ ID N0. 5 所示)tdh 基因的探针5~ -CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3、；(如 SEQ ID N0. 6 所示)探针的5、端标记有荧光报告基团，3、端标记有荧光淬灭基团，两探针的5、端标记 的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。所述的荧光报告基团优选为FAM、HEX或VIC，所述的荧光淬灭基团优选为BHQl。本发明的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反5应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物包括两对(1)针对 toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 1 所示)5:CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)(2)针对 tdh 基因5:GGCTGACATCCTACATGACTG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)5~-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3、；(如 SEQ ID NO. 4 所示)所述的检测探针包括(1) toxR基因的探针5~ -AGGATTCACAGCAGMGCCACAGG-3、；(如 SEQ ID N0. 5所示)(2) tdh 基因的探针5~ -CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3、；(如 SEQ ID N0. 6 所 示)探针的5、端标记有荧光报告基团，3、端标记有荧光淬灭基团，两探针的5、端标记 的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。本发明的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测方法，用于检测食品或海产品，其 特征在于，包括以下步骤(1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；(2)使用上述针对toxR基因和tdh基因的检测引物及其检测探针，与实时荧光 PCR扩增用的反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据 探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数 (Ct)；(4)根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有副溶血性弧 菌，以及该副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。所述的步骤O)的扩增反应体系优选为本发明公开了一种副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明利用双重实时荧光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作为靶基因，toxR基因用于特异性检测副溶血性弧菌，tdh基因用于检测是否携带毒力基因，优化设计引物、探针和反应条件，使得在一次扩增反应中对副溶血性弧菌进行特异性检测的同时检测其毒力基因，检测快速，8-10小时可以完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为副溶血性弧菌进行流行病学调查提供了有利工具。适用于食品以及海产品的检验检疫，可供检验检疫局、疾病预防控制中心和质量监督部门对样品进行简便、快速、准确的检测。