专利名称：用于治疗和诊断肺癌的化合物和方法一般地，本发明涉及癌症，例如肺癌的治疗和诊断。更具体地，本发明涉及含有肺肿瘤蛋白质的至少一个部分的多肽，和编码这些多肽的多核苷酸。这些多肽和多核苷酸可以用于疫苗和药物组合物中以防止和治疗肺癌，以及诊断和监测这些癌症。在美国，肺癌是男性和女性癌症死亡的主要原因，据报道1994年就估计有172,000个新病例。无论诊断时疾病的阶段如何，在所有的肺癌患者中，5年的存活率仅为13％。这与当该疾病还处于局部时检测到的病例中46％的5年存活率形成对照。然而，仅有16％的肺癌在该疾病扩散之前被发现。由于通常一直要到该痰病达到晚期时才可观察到临床症状，故早期检测是困难的。目前，该疾病的诊断借助于胸部X射线、对痰中所含的细胞类型的分析、和支气管通道的光纤检查。治疗方案取决于该癌症的类型和阶段，包括手术、放疗和/或化疗。尽管对于肺癌的治疗已有了相当多的研究，但该疾病仍难于医治。因此，本领域对用于肺癌的改良疫苗、治疗方法和诊断技术仍存在需要。发明概述简而言之，本发明提供用于诊断和治疗癌症，例如肺癌的组合物和方法。一方面，本发明提供含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少一个部分的多肽。某些部分和其它变体具有免疫原性，以致该变体与抗原特异性抗血清的反应能力在相当大程度得到保持。在某些实施方案中，该多肽含有由选自下组的多核苷酸序列编码的序列(a)SEQ ID NO1-3、6-8、10-13、5-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、8、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253-337、345、347和349之任一个中所示的序列；(b)SEQ ID NO1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253-337、345、347和349之任一个中所示序列的变体；和(c)(a)或(b)序列的互补序列、在具体的实施方案中，本发明的多肽含有包括选自下组的氨基酸序列的肿瘤蛋白质的至少一个部分SEQ ID NO152、155、156、165、166、169、170、172、174、176、226-252、338-334和346之任意一个中的所示序列和其变体。本发明还提供编码上述多肽的多核苷酸或其部分(例如编码肺肿瘤蛋白质的至少15个氨基酸残基的部分)，含有这些多核苷酸的表达载体和用这些表达载体转化或转染的宿主细胞。在其它方面，本发明提供含有上述多肽或多核苷酸和生理学上可接受载体的药物组合物。在本发明的一个相关方面，提供用于预防或治疗用途的疫苗。这些疫苗含有上述多肽或多核苷酸和免疫刺激剂。
本发明还提供药物组合物，其含有(a)特异地与肺肿瘤蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段；和(b)生理学上可接受的载体。
在其它方面，本发明提供药物组合物，其含有(a)表达上述多肽的抗原呈递细胞和(b)可药用载体或赋形剂。抗原呈递细胞包括树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和B细胞。
在相关方面中，本发明提供疫苗，其含有(a)表达上述多肽的抗原呈递细胞，和(b)免疫刺激剂。
在其它方面，本发明还提供含有至少一种上述多肽的融合蛋白，以及编码这些融合蛋白的多核苷酸。
在相关方面中，本发明提供含有融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸，及生理学上可接受载体的药物组合物。
在其它方面，本发明还提供含有融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸，及免疫刺激剂的疫苗。
在其它方面，本发明提供用于抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用上述药物组合物或疫苗。
在其它方面中，本发明还提供用于从生物样品中除去肿瘤细胞的方法，包括用特异地与肺肿瘤蛋白质反应的T细胞接触生物样品，其中该接触步骤在足以允许从该样品中除去表达该蛋白质的细胞的条件和时间下进行。
在相关方面，本发明提供用于抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用按上述方法处理过的生物样品。
在其它方面，本发明还提供用于刺激和/或扩增肺肿瘤蛋白质特异性T细胞的方法，包括在足以刺激和/或扩增T细胞的条件和时间下，用以下一或多种物质接触T细胞(i)上述多肽；(ii)编码该多肽的多核苷酸；和/或(iii)表达该多肽的抗原呈递细胞。本发明还提供含有按上述方法制备的T细胞的确定T细胞群。
在其它方面，本发明提供用于抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用有效量的上述T细胞群。
本发明还提供用于抑制患者体内癌症发展的方法，包括步骤(a)用以下一或多种物质与来自患者的确定CD4+和/或CD8+T细胞一起孵育(i)含有肺肿瘤蛋白质的至少免疫原性部分的多肽；(ii)编码该多肽的多核苷酸；和(iii)表达该多肽的抗原呈递细胞；和(b)给患者施用有效量的该增殖T细胞，并籍此抑制患者体内的癌症发展。在给患者施用之前，可以，但并不必须，对增殖细胞进行克隆。
在其它方面，本发明提供用于确定患者体内是否存在癌症的方法，包括(a)用与上述多肽结合的结合剂接触获自患者的生物样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的量；和(c)将该多肽量和预先确定的截断值(cut-off value)进行比较，由此确定患者体内是否存在癌症。在优选的实施方案中，该结合剂是抗体，更优选的是单克隆抗体。该癌症可以是肺癌。
在其它方面，本发明还提供用监测患者体内癌症进展趋势的方法。该方法包括步骤(a)用与上述多肽结合的结合剂接触在第一时间点上从患者获得的生物样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的量；(c)采用在随后的时间点上从该患者获得的生物样品，重复步骤(a)和(b)；和(d)将步骤(c)中检测到的多肽量和步骤(b)中检测到的量进行比较，并由此监测患者体内癌症的进展趋势。
在其它方面，本发明还提供用于确定患者体内是否存在癌症的方法，包括步骤(a)用与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触获自患者的生物样品；(b)检测该样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸，优选mRNA，的水平；和(c)将与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的水平与预确定的截断值进行比较，由此确定该患者体内是否存在癌症。在某些实施方案中，采用例如至少一个与编码上述多肽的多核苷酸或该多核苷酸的互补序列杂交的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应，检测该mRNA的量。在其它实施方案中，利用与编码上述多肽的多核苷酸或该多核苷酸的互补序列杂交的寡核苷酸探针，采用杂交技术，检测该mRNA的量。
在相关方面，本发明提供用于监测患者体内癌症进展趋势的方法，包括步骤(a)用与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触获自患者的生物样品；(b)检测该样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；(c)采用在随后时间点上从该患者获得的生物样品，重复步骤(a)和(b)；和(d)将步骤(c)中检测到的多核苷酸量与步骤(b)中检测到的量进行比较，由此监测该患者体内癌症的进展趋势。
在其它方面，本发明提供与上述多肽结合的抗体，例如单克隆抗体，以及含有这些抗体的诊断试剂盒。还提供含有上述一或多个寡核苷酸探针或引物的诊断试剂盒。
参考以下详述和附图
，本发明的这些和其它方面将是明了的。本文公开的所有文献特此以参考文献的形式完整地并入，如同每篇文献单独并入一样序列名称SEQ ID NO1是LST-S2-2的测定的cDNA序列SEQ ID NO2是LST-S2-28的测定的cDNA序列SEQ ID NO3是LST-S2-90的测定的cDNA序列SEQ ID NO4是LST-S2-144的测定的cDNA序列SEQ ID NO5是LST-S2-133的测定的cDNA序列SEQ ID NO6是LST-S2-169的测定的cDNA序列SEQ ID NO7是LST-S2-6的测定的cDNA序列SEQ ID NO8是LST-S2-11的测定的cDNA序列SEQ ID NO9是LST-S2-17的测定的cDNA序列SEQ ID NO10是LST-S2-25的测定的cDNA序列SEQ ID NO11是LST-S2-39的测定的cDNA序列SEQ ID NO12是LST-S2-43的第一种测定的cDNA序列SEQ ID NO13是LST-S2-43的第二种测定的cDNA序列SEQ ID NO14是LST-S2-65的测定的cDNA序列SEQ ID NO15是LST-S2-68的测定的cDNA序列SEQ ID NO16是LST-S2-72的测定的cDNA序列SEQ ID NO17是LST-S2-74的测定的cDNA序列SEQ ID NO18是LST-S2-103的测定的cDNA序列SEQ ID NO19是LST-S2-N1-1F的测定的cDNA序列SEQ ID NO20是LST-S2-N1-2A的测定的cDNA序列SEQ ID NO21是LST-S2-N1-4H的测定的cDNA序列SEQ ID NO22是LST-S2-N1-5A的测定的cDNA序列SEQ ID NO23是LST-S2-N1-6B的测定的cDNA序列SEQ ID NO24是LST-S2-N1-7B的测定的cDNA序列SEQ ID NO25是LST-S2-N1-7H的测定的cDNA序列SEQ ID NO26是LST-S2-N1-8A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO27是LST-S2-N1-8D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO28是LST-S2-N1-9A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO29是LST-S2-N1-9E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO30是LST-S2-N1-10A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO31是LST-S2-NI-10G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO32是LST-S2-N1-11A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO33是LST-S2-N1-12C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO34是LST-S2-N1-12E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO35是LST-S2-B1-3D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO36是LST-S2-B1-6C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO37是LST-S2-B1-5D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO38是LST-S2-B1-5F的测定的cDNA序列。SEQ ID NO39是LST-S2-B1-6G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO40是LST-S2-B1-8A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO41是LST-S2-B1-8D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO42是LST-S2-B1-10A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO43是LST-S2-B1-9B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO44是LST-S2-B1-9F的测定的cDNA序列。SEQ ID NO45是LST-S2-B1-12D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO46是LST-S2-I2-2B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO47是LST-S2-I2-5F的测定的cDNA序列。SEQ ID NO48是LST-S2-I2-6B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO49是LST-S2-I2-7F的测定的cDNA序列。SEQ ID NO50是LST-S2-I2-8G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO51是LST-S2-I2-9E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO52是LST-S2-I2-12B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO53是LST-S2-H2-2C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO54是LST-S2-H2-1G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO55是LST-S2-H2-4G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO56是LST-S2-H2-3H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO57是LST-S2-H2-5G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO58是LST-S2-H2-9B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO59是LST-S2-H2-10H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO60是LST-S2-H2-12D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO61是LST-S3-2的测定的cDNA序列。SEQ ID NO62是LST-S3-4的测定的cDNA序列。SEQ ID NO63是LST-S3-7的测定的cDNA序列。SEQ ID NO64是LST-S3-8的测定的cDNA序列。SEQ ID NO65是LST-S3-12的测定的cDNA序列。SEQ ID NO66是LST-S3-13的测定的cDNA序列。SEQ ID NO67是LST-S3-14的测定的cDNA序列。SEQ ID NO68是LST-S3-16的测定的cDNA序列。SEQ ID NO69是LST-S3-21的测定的cDNA序列。SEQ ID NO70是LST-S3-22的测定的cDNA序列。SEQ ID NO71是LST-S1-7的测定的cDNA序列。SEQ ID NO72是LST-S1-A-1E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO73是LST-S1-A-1G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO74是LST-S1-A-3E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO75是LST-S1-A-4E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO76是LST-S1-A-6D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO77是LST-S1-A-8D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO78是LST-S1-A-10A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO79是LST-S1-A-10C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO80是LST-S1-A-9D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO81是LST-S1-A-10D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO82是LST-S1-A-9H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO83是LST-S1-A-11D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO84是LST-S1-A-12D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO85是LST-S1-A-11E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO86是LST-S1-A-12E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO87是L513S(T3)的测定的cDNA序列。SEQ ID NO88是L513S重叠群1的测定的cDNA序列。SEQ ID NO89是L514S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO90是L514S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO91是L516S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO92是L516S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO93是L517S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO94是LST-S1-169(又称L519S)的扩延cDNA序列。SEQ ID NO95是L520S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO96是L520S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO97是L521S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO98是L521S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO99是L522S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO100是L523S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO101是L524S的测定的cDNA序列。SEQ ID N0102是L525S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO103是L526S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO104是L527S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO105是L528S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO106是L529S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO107是L530S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO108是L530S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO109是L531S短形式的测定的全长cDNA序列。SEQ ID NO110是推测的SEQ ID NO109编码的氨基酸序列。SEQ ID NO111是L531S长形式的测定的全长cDNA序列。SEQ ID NO112是推测的SEQ ID NO111编码的氨基酸序列。SEQ ID NO113是L520S的测定的全长cDNA序列。SEQ ID NO114是推测的SEQ ID NO113编码的氨基酸序列。SEQ ID NO115是重叠群1的测定的cDNA序列。SEQ ID NO116是重叠群3的测定的cDNA序列。SEQ ID NO117是重叠群4的测定的cDNA序列。SEQ ID NO118是重叠群5的测定的cDNA序列。SEQ ID NO119是重叠群7的测定的cDNA序列。SEQ ID NO120是重叠群8的测定的cDNA序列。SEQ ID NO121是重叠群9的测定的cDNA序列。SEQ ID NO122是重叠群10的测定的cDNA序列。SEQ ID NO123是重叠群12的测定的cDNA序列。SEQ ID NO124是重叠群11的测定的cDNA序列。SEQ ID NO125是重叠群13的测定的cDNA序列。SEQ ID NO126是重叠群15的测定的cDNA序列。SEQ ID NO127是重叠群16的测定的cDNA序列。SEQ ID NO128是重叠群17的测定的cDNA序列。SEQ ID NO129是重叠群19的测定的cDNA序列。SEQ ID NO130是重叠群20的测定的cDNA序列。SEQ ID NO131是重叠群22的测定的cDNA序列。SEQ ID NO132是重叠群24的测定的cDNA序列。SEQ ID NO133是重叠群29的测定的cDNA序列。SEQ ID NO134是重叠群31的测定的cDNA序列。SEQ ID NO135是重叠群33的测定的cDNA序列。SEQ ID NO136是重叠群38的测定的cDNA序列。SEQ ID NO137是重叠群39的测定的cDNA序列。SEQ ID NO138是重叠群41的测定的cDNA序列。SEQ ID NO139是重叠群43的测定的cDNA序列。SEQ ID NO140是重叠群44的测定的cDNA序列。SEQ ID NO141是重叠群45的测定的cDNA序列。SEQ ID NO142是重叠群47的测定的cDNA序列。SEQ ID NO143是重叠群48的测定的cDNA序列。SEQ ID NO144是重叠群49的测定的cDNA序列。SEQ ID NO145是重叠群50的测定的cDNA序列。SEQ ID NO146是重叠群53的测定的cDNA序列。SEQ ID NO147是重叠群54的测定的cDNA序列。SEQ ID NO148是重叠群56的测定的cDNA序列。SEQ ID NO149是重叠群57的测定的cDNA序列。SEQ ID NO150是重叠群58的测定的cDNA序列。SEQ ID NO151是L530S的全长cDNA序列。SEQ ID NO152是SEQ ID NO151编码的氨基酸序列。SEQ ID NO153是L514S第一个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO154是L514S第二个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO155是SEQ ID NO153编码的氨基酸序列。SEQ ID NO156是SEQ ID NO154编码的氨基酸序列。SEQ ID NO157是重叠群59的测定的cDNA序列。SEQ ID NO158是L763P(又称作重叠群22)的全长cDNA序列。SEQ ID NO159是SEQ ID NO158编码的氨基酸序列。SEQ ID NO160是L762P(又称作重叠群17)的全长cDNA序列。SEQ ID NO161是SEQ ID NO160编码的氨基酸序列。SEQ ID NO162是L515S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO163是L524S第一个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO164是L524S第二个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO165是SEQ ID NO163编码的氨基酸序列。SEQ ID NO166是SEQ ID NO164编码的氨基酸序列。SEQ ID NO167是L762P第一个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO168是L762P第二个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO169是SEQ ID NO167编码的氨基酸序列。SEQ ID NO170是SEQ ID NO168编码的氨基酸序列。SEQ ID NO171是L773P(又称作重叠群56)的全长cDNA序列。SEQ ID NO172是SEQ ID NO171编码的氨基酸序列。SEQ ID NO173是L519S的扩延cDNA序列。SEQ ID NO174是推测的SEQ ID NO174编码的氨基酸序列。SEQ ID NO175是L523S的全长cDNA序列。SEQ ID NO176是推测的SEQ ID NO175编码的氨基酸序列。SEQ ID NO177是LST-sub5-7A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO178是LST-sub5-8G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO179是LST-sub5-8H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO180是LST-sub5-10B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO181是LST-sub5-10H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO182是LST-sub5-12B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO183是LST-sub5-11C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO184是LST-sub6-1c的测定的cDNA序列。SEQ ID NO185是LST-sub6-2f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO186是LST-sub6-2G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO187是LST-sub6-4d的测定的cDNA序列。SEQ ID NO188是LST-sub6-4e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO189是LST-sub6-4f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO190是LST-sub6-3h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO191是LST-sub6-5d的测定的cDNA序列。SEQ ID NO192是LST-sub6-5h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO193是LST-sub6-6h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO194是LST-sub6-7a的测定的cDNA序列。SEQ ID NO195是LST-sub6-8a的测定的cDNA序列。SEQ ID NO196是LST-sub6-7d的测定的cDNA序列。SEQ ID NO197是LST-sub6-7e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO198是LST-sub6-8e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO199是LST-sub6-7g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO200是LST-sub6-9f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO201是LST-sub6-9h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO202是LST-sub6-11b的测定的cDNA序列。SEQ ID NO203是LST-sub6-11c的测定的cDNA序列。SEQ ID NO204是LST-sub6-12c的测定的cDNA序列。SEQ ID NO205是LST-sub6-12e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO206是LST-sub6-12f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO207是LST-sub6-11g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO208是LST-sub6-12g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO209是LST-sub6-12h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO210是LST-sub6-II-1a的测定的cDNA序列。SEQ ID NO211是LST-sub6-II-2b的测定的cDNA序列。SEQ ID NO212是LST-sub6-II-2g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO213是LST-sub6-II-1h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO214是LST-sub6-II-4a的测定的cDNA序列。SEQ ID NO215是LST-sub6-II-4b的测定的cDNA序列。SEQ ID NO216是LST-sub6-II-3e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO217是LST-sub6-II-4f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO218是LST-sub6-II-4g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO219是LST-sub6-II-4h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO220是LST-sub6-II-5c的测定的cDNA序列。SEQ ID NO221是LST-sub6-II-5e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO222是LST-sub6-II-6f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO223是LST-sub6-II-5g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO224是LST-sub6-II-6g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO225是L528S的氨基酸序列。SEQ ID NO226-251是来源于L762P的合成肽。SEQ ID NO252是L514S的表达氨基酸序列。SEQ ID NO253是相应于SEQ ID NO252的DNA序列。SEQ ID NO254是L762P表达结构的DNA序列。SEQ ID NO255是克隆23785的测定的cDNA序列。SEQ ID NO256是克隆23786的测定的cDNA序列。SEQ ID NO257是克隆23788的测定的cDNA序列。SEQ ID NO258是克隆23790的测定的cDNA序列。SEQ ID NO259是克隆23793的测定的cDNA序列。SEQ ID NO260是克隆23794的测定的cDNA序列。SEQ ID NO261是克隆23795的测定的cDNA序列。SEQ ID NO262是克隆23796的测定的cDNA序列。SEQ ID NO263是克隆23797的测定的cDNA序列。SEQ ID NO264是克隆23798的测定的cDNA序列。SEQ ID NO265是克隆23799的测定的cDNA序列。SEQ ID NO266是克隆23800的测定的cDNA序列。SEQ ID NO267是克隆23802的测定的cDNA序列。SEQ ID NO268是克隆23803的测定的cDNA序列。SEQ ID NO269是克隆23804的测定的cDNA序列。SEQ ID NO270是克隆23805的测定的cDNA序列。SEQ ID NO271是克隆23806的测定的cDNA序列。SEQ ID NO272是克隆23807的测定的cDNA序列。SEQ ID NO273是克隆23808的测定的cDNA序列。SEQ ID NO274是克隆23809的测定的cDNA序列。SEQ ID NO275是克隆23810的测定的cDNA序列。SEQ ID NO276是克隆23811的测定的cDNA序列。SEQ ID NO277是克隆23812的测定的cDNA序列。SEQ ID NO278是克隆23813的测定的cDNA序列。SEQ ID NO279是克隆23815的测定的cDNA序列。SEQ ID NO280是克隆25298的测定的cDNA序列。SEQ ID NO281是克隆25299的测定的cDNA序列。SEQ ID NO281是克隆25299的测定的cDNA序列。SEQ ID NO282是克隆25300的测定的cDNA序列。SEQ ID NO283是克隆25301的测定的cDNA序列。SEQ ID NO284是克隆25304的测定的cDNA序列。SEQ ID NO285是克隆25309的测定的cDNA序列。SEQ ID NO286是克隆25312的测定的cDNA序列。SEQ ID NO287是克隆25317的测定的cDNA序列。SEQ ID NO288是克隆25321的测定的cDNA序列。SEQ ID NO289是克隆25323的测定的cDNA序列。SEQ ID NO290是克隆25327的测定的cDNA序列。SEQ ID NO291是克隆25328的测定的cDNA序列。SEQ ID NO292是克隆25332的测定的cDNA序列。SEQ ID NO293是克隆25333的测定的cDNA序列。SEQ ID NO294是克隆25336的测定的cDNA序列。SEQ ID NO295是克隆25340的测定的cDNA序列。SEQ ID NO296是克隆25342的测定的cDNA序列。SEQ ID NO297是克隆25356的测定的cDNA序列。SEQ ID NO298是克隆25357的测定的cDNA序列。SEQ ID NO299是克隆25361的测定的cDNA序列。SEQ ID NO300是克隆25363的测定的cDNA序列。SEQ ID NO301是克隆25397的测定的cDNA序列。SEQ ID NO302是克隆25402的测定的cDNA序列。SEQ ID NO303是克隆25403的测定的cDNA序列。SEQ ID NO304是克隆25405的测定的cDNA序列。SEQ ID NO305是克隆25407的测定的cDNA序列。SEQ ID NO306是克隆25409的测定的cDNA序列。SEQ ID NO307是克隆25396的测定的cDNA序列。SEQ ID NO308是克隆25414的测定的cDNA序列。SEQ ID NO309是克隆25410的测定的cDNA序列。SEQ ID NO310是克隆25406的测定的cDNA序列。SEQ ID NO311是克隆25306的测定的cDNA序列。SEQ ID NO312是克隆25362的测定的cDNA序列。SEQ ID NO313是克隆25360的测定的cDNA序列。SEQ ID NO314是克隆25398的测定的cDNA序列。SEQ ID NO315是克隆25355的测定的cDNA序列。SEQ ID NO316是克隆25351的测定的cDNA序列。SEQ ID NO317是克隆25331的测定的cDNA序列。SEQ ID NO318是克隆25338的测定的cDNA序列。SEQ ID NO319是克隆25335的测定的cDNA序列。SEQ ID NO320是克隆25329的测定的cDNA序列。SEQ ID NO321是克隆25324的测定的cDNA序列。SEQ ID NO322是克隆25322的测定的cDNA序列。SEQ ID NO323是克隆25319的测定的cDNA序列。SEQ ID NO324是克隆25316的测定的cDNA序列。SEQ ID NO325是克隆25311的测定的cDNA序列。SEQ ID NO326是克隆25310的测定的cDNA序列。SEQ ID NO327是克隆25302的测定的cDNA序列。SEQ ID NO328是克隆25315的测定的cDNA序列。SEQ ID NO329是克隆25308的测定的cDNA序列。SEQ ID NO330是克隆25303的测定的cDNA序列。SEQ ID NO331-337是p53肿瘤抑制基因的同系物p63的同种型的cDNA序列(又称L530S)。SEQ ID NO338-344分别是SEQ ID NO331-337编码的氨基酸序列。SEQ ID NO345是抗原L763P的第二种cDNA序列。SEQ ID NO346是SEQ ID NO345序列编码的氨基酸序列。SEQ ID NO347是L523S的测定的全长cDNA序列。SEQ ID NO348是推测的SEQ ID NO347编码的氨基酸序列。SEQ ID NO349是编码L773PN端部分的cDNA序列。SEQ ID NO350是L773P N端部分的氨基酸序列。发明详述正如以上指出的，本发明一般指向用于治疗和诊断癌症例如肺癌的组合物和方法。本文所述组合物可以包括肺肿瘤多肽、编码这些多肽的多核苷酸、抗体等结合剂、抗原呈递细胞(APC)和/或免疫系统细胞(例如T细胞)。本发明多肽一般含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少一个部分(例如免疫原性部分)。“肺肿瘤蛋白质”是当采用本文提供的代表性分析方法测定时，以高于正常组织中的表达水平至少2倍、优选至少5倍的水平在肺肿瘤细胞中表达的蛋白质。某些肺肿瘤蛋白质是(在免疫测定法中，例如ELISA或Western印迹)可检测地与肺癌患者抗血清反应的肿瘤蛋白质。本发明的多核苷酸一般含有编码该多肽的全部或部分的DNA或RNA序列、或与该序列互补的序列。抗体一般是指能与上述多肽结合的免疫系统蛋白质、或其抗原结合片段。抗原呈递细胞包括表达上述多肽的树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和B细胞。可以用于这些组合物的T细胞一般是对上述多肽具有特异性的T细胞。本发明以发现的人肺肿瘤蛋白质为基础。编码具体肿瘤蛋白质的多核苷酸序列见SEQ ID NO1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349。肺肿瘤蛋白质的多核苷酸编码本文所述肺肿瘤蛋白质、或其部分或其它变体的任何多核苷酸均包括在本发明内。优选的多核苷酸含有编码肺肿瘤蛋白质一部分的至少15个连续核苷酸、优选至少30个连续核苷酸、更优选至少45个连续核苷酸。更优选地，多核苷酸编码肺肿瘤蛋白质的免疫原性部分。与任何这些序列互补的多核苷酸也包括在本发明之内。多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，而且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子并以一对一形式与DNA分子对应的HnRNA分子，和不含内含子的mRNA分子。本发明多核苷酸中可以，但不必须，存在其它编码或非编码序列，而且可以，但不必须，将多核苷酸与其它分子和/或支持材料连接在一起。
多核苷酸可以含有天然序列(即编码肺肿瘤蛋白质或其部分的内源性序列)或可以含有该序列的变体。多核苷酸变体可以含有一或多个替代、添加、缺失和/或插入，以致所编码的多肽的免疫原性相对于天然肿瘤蛋白质得到保持。一般可以按本文所述方法评价对该编码多肽的免疫原性的影响。变体优选表现出与编码天然肺肿瘤蛋白质或其部分的多核苷酸序列有至少约70％的一致性、更优选至少约80％的一致性、最优选至少约90％的一致性。术语“变体”也包括异种来源的同源基因。
如果在按下述方法进行最大匹配比对后，两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则认为这两个序列是“一致的”。典型地，两个序列之间的比较通过在比较窗中对序列进行比较以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。本文所用“比较窗”是指具有至少约20个连续位置，通常30-约75个，40-约50个连续位置的区段，在该区段中可以在两个序列最佳对齐后比较该序列与具有相同连续位置数目的参考序列。
为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。该程序体现了以下文献中所述的几个比对策略Dayhoff，M.O.(1978)蛋白质的进化改变模型-检测远缘关系的矩阵，见Dayhoff，M.O.(编)《蛋白质序列和结构图集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，国立生物化学研究基金会，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358页；Hein J.(1990)比对和系统发生的统一方法，第626-645页，《酶学方法》(Methods in Enzymology)第183卷，Academic Press公司，SanDiego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P，M.(1989)CABIOS 5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《数值分类学-数值分类学的原理和实践》(Numerical Taxonomy-the Principlesand Practice of Numerical Taxonomy)，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80726-730。
优选地，“序列一致性百分数”通过在至少有20个位置的比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了获得两个序列的最佳比对，与参考序列(不含有插入或缺失)相比，该比较窗中的该多核苷酸或多肽序列部分可以含有20％或更少，通常5-15％，或10-12％的插入或缺失(即间隔区)。该百分数的计算方法是确定这两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以获得匹配位置数，用该匹配位置数除以该参考序的总位置数(即该窗的大小)，然后将所获结果乘以100以产生该序列一致性百分数。
变体还可以，或者是作为替代方案可以，和天然基因，或其部分或互补序列在相当大程度上同源。这些多核苷酸变体能够在中等严紧条件下与编码天然肺肿瘤蛋白质的天然存在DNA序列(或互补序列)杂交。适合的中等严紧条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗涤；在5×SSC中50℃-65℃杂交过夜；之后用含有0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC于65℃ 20分钟各进行2次洗涤。
本领域的普通技术人员将明了，由于遗传密码的简并性，有许多编码本文所述多肽的多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与所有天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸是本发明所具体考虑的。而且，含有本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也属于本发明的范围。等位基因是由于一或多个突变，例如核苷酸的缺失、添加和/或替代，而造成改变的内源性基因。所导致的mRNA和蛋白质可以，但不必，具有改变的结构或功能。可以采用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。
多核苷酸可以采用多种技术中的任一种来制备。例如，可以按以下详细描述的方法，通过筛选微阵列cDNA寻找肿瘤相关表达(即，按本文提供的代表性分析方法测定的、在肿瘤细胞中比在正常组织中高出至少2倍的表达)，鉴定多核苷酸。可以采用Synteni微阵列(Palo Alto，CA)，根据厂家说明书(以及基本上按Schena等，美国国家科学院院刊9310614-10619，1996和Heller等，美国国家科学院院刊942150-2155，1997中所描述的方法)，进行这些筛选。或者，可以从表达本文所述蛋白质的细胞(例如肺肿瘤细胞)中制备cDNA，然后从该cDNA扩增多肽。这些多核苷酸可以通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。对于该方法，序列特异性引物可以基于本文所提供的序列进行设计，并可以通过购买或合成获得。
根据熟知技术，可以采用扩增的部分从适合的文库(例如肺肿瘤cDNA文库)中分离全长基因。在这些技术中，可采用一或多个多核苷酸探针或适于扩增的引物筛选文库(cDNA或基因组文库)。优选地，对文库进行大小筛选以包括较大分子。还可以优选随机引物产生的文库(randomprimed libraries)以鉴定基因的5’和上游区域。优选基因组文库以获得内含子和延伸的5’序列。
对于杂交技术，可以采用熟知技术(例如用32P通过切口平移或末端标记)标记部分序列。然后通过用该标记探针杂交含有变性的细菌菌落(或含有噬菌斑的菌苔)的滤膜，筛选细菌或噬菌体文库(见Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989)。筛选和扩增杂交的菌落或噬菌斑，并分离该DNA用于进一步分析。可以通过例如PCR，采用来自该部分序列的引物和来自载体的引物，分析cDNA克隆以确定额外序列的量。可以制备限制性图谱和部分序列，以鉴定一个或多个重叠克隆。然后采用标准技术确定该完整序列，这些技术可能涉及产生一系列缺失克隆。然后将该所获重叠序列组装成一个连续序列。可以采用熟知技术，通过将适合的片段连接在一起，产生全长cDNA分子。
作为可选择的方案，有许多扩增技术可以用于从部分cDNA序列获得全长编码序列。在这些技术中，一般通过PCR进行扩增。可以采用多种可从商业途径获得的试剂盒中的任一种，实施扩增步骤。引物可以采用例如本领域熟知的软件来设计。引物优选长22-30个核苷酸，具有至少50％的GC含量，并可以在约68℃-72℃的温度下与靶序列退火。可以按以上所述方法对扩增区域进行测序，然后将重叠的序列组装成一个连续序列。
一个这样的扩增技术是反向PCR(见Triglia等，核酸研究(Nucl.Acids Res。)168186，1988)，该技术采用限制性酶在基因的已知区域中产生片段。然后，通过分子内连接使该片段环化，并作为模板与来源于该已知区域的背驰引物(divergent primers)一起用于PCR。在另一个方法中，与部分序列相邻的序列可以通过采用针对接头序列的引物和已知区域所特异的引物进行扩增来获得。典型地，该扩增序列采用相同的接头引物和该已知区域所特异的第二个引物进行第二轮扩增。该方法的一个变体采用了从该已知区域以相反方向起始延伸的两个引物，其描述于WO 96/38591中。另一种此类技术称作“cDNA末端的快速扩增”或RACE。该技术涉及到应用一个内部引物和一个与polyA区域或载体序列杂交的外部引物来鉴定已知序列的5’和3’序列。其它技术包括捕获PCR(capturePCR)(Lagerstrom等，PCR方法应用(PCR Methods Applic.)1111-19，1991)和步行PCR(walking PCR)(Parker等，核酸研究193055-60，1991)。还可以采用其它利用扩增的方法以获得全长cDNA序列。
在某些情况下，可以通过分析已表达序列标志(EST)数据库，例如可从GenBank获得的EST数据库中提供的序列，获得全长cDNA序列。一般可以采用熟知程序(例如NCBI BLAST搜索程序)搜索重叠的EST，并可以采用这些EST产生连续的全长序列。还可以通过分析基因组片段获得全长DNA序列。
编码肺肿瘤蛋白质的部分的一些cDNA分子核酸序列见SEQ ID NO1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349。
多核苷酸变体一般可以通过本领域已知的任何方法来制备，包括通过例如固相亚磷酰胺化学合成法进行化学合成。还可以采用标准诱变技术，例如寡核苷酸指导的位点特异性诱变(见Adelman等，DNA 2183，1983)，在多核苷酸序列中引入修饰。或者，可以通过体外或体内转录编码肺肿瘤蛋白质或其部分的DNA序列，产生RNA分子，前提是将该DNA序列插入带有适合RNA聚合酶启动子(例如T7或SP6)的载体中。按本文所述，某些部分可以用于制备编码的多肽。此外，或作为可供选择的方案，可以给患者施用部分序列，以便体内产生该编码多肽(例如通过用编码肺肿瘤多肽的cDNA结构转染抗原呈递细胞，例如树突细胞，然后给该患者施用此转染的细胞)。
还可以将与编码序列互补的部分序列(即反义多核苷酸)用作探针，或用以调节基因表达。还可以将能够转录出反义RNA的cDNA结构引入组织的细胞中，以便于反义RNA的产生。按本文所述，可以利用反义多核苷酸抑制肿瘤蛋白质的表达。反义技术通过形成三股螺旋妨碍双螺旋充分展开以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力，可以用于控制基因表达(见Gee等，Huber和Carr，《分子和免疫学方法(Molecular andImmunologic Approaches)》，Futura Pulishing Co.(Mt.Kisco，NY；1994))。或者，可以设计反义分子与基因控制区域(例如启动子、增强子或转录起始位点)杂交并阻断该基因的转录；或通过抑制转录本与核糖体的结合阻断翻译。
还可以将部分编码序列或互补序列设计成探针或引物以检测基因表达。探针可以用多种报道基团(例如放射性核素和酶)标记，并优选长至少10个核苷酸，更优选长至少20个核苷酸，甚至更优选长至少30个核苷酸。正如以上指出的，引物优选长22-30个核苷酸。
可以对任何多核苷酸作进一步修饰，以增加其在体内的稳定性。可能的修饰包括，但不限于，在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在骨架中采用硫代硫酸酯或2’O-甲基而非磷酸二酯酶键；和/或在其中包含非常规碱基，例如次黄苷、queosine、wybutosine，以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基、甲基、硫代、及其它修饰形式。
可以采用成熟的重组DNA技术将本文所描述的核苷酸序列与各种其它核苷酸序列连接起来。例如，可以将多核苷酸克隆在多种克隆载体的任意一种中，这些载体包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒。尤其有意义的载体包括表达载体、复制载体、探针制备用载体和测序载体。一般地，载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记。其它元件将由期望的用途决定，并且将是本领域普通技术人员所明了的。
在某些实施方案中，可以对多核苷酸进行配制，以便使其能进入哺乳动物细胞中，并在其中表达。这些制剂对于治疗目的是尤其有用的，见下述。本领域普通技术人员将明了，实现多核苷酸在靶细胞中的表达有多种途径，而且可以采用任何适合的方法来进行。例如，可以将多核苷酸导入病毒载体中，这些载体例如，但不限于，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、或痘苗病毒或其它痘病毒(例如禽类痘病毒)。还可以将多核苷酸作为裸质粒载体进行施用。用于将DNA插入这些载体中的技术是本领域普通技术人员所熟知的。此外，逆转录病毒载体还可以转移或掺入基因作为选择标记(以帮助鉴定或筛选转导的细胞)和/或导向部分，例如针对特异靶细胞上受体的配体的编码基因，以使该载体具有靶标特异性。也可以采用抗体，通过本领域配体技术人员已知的方法，实现导向。
用于治疗目的的其它制剂包括胶体分散系统，例如高分子复合物、纳米囊剂(nanocapsules)、微球体、小珠，和基于脂质的系统，包括水包油型乳剂、微胶粒、混合微胶粒、和脂质体。用作体外和体内递送载体的优选胶体系统是脂质体(即人造膜载体)。这些系统的制备和应用是本领域所熟知的。肺肿瘤多肽在本发明的上下文中，本文所述多肽可以含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少免疫原性部分。正如以上所指出的，“肺肿瘤蛋白质”是肺肿瘤细胞表达的蛋白质。作为肺肿瘤蛋白质的蛋白质与肺癌患者的抗血清之间的反应可在免疫测定(例如ELISA)中检测到。本文所述多肽可以是任何长度。还可以存在来源于该天然蛋白质和/或异源序列的其它序列，而且这些序列可以(但不必须)也具有免疫原或抗原性质。
“免疫原性部分”在本文中用于指被B细胞和/T细胞表面抗原受体识别(即特异结合)的蛋白质部分。这些免疫原性部分一般含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少5个氨基酸残基、更优选至少10个、甚至更优选至少20个氨基酸残基。某些优选的免疫原性部分包括N端前导序列和/或跨膜域已经缺失的肽。其它优选的免疫原性部分可以相对于成熟蛋白质含有小的N-和/或C-端缺失(例如1-30个氨基酸，优选5-15个氨基酸)。
一般可以采用熟知的技术，例如Paul，基础免疫学(FundamentalImmunology)，第3版，第243-247页(Raven Press，1993)及其中所引用的文献中总结的那些技术，鉴定免疫原性部分。这些技术包括筛选能够与抗原特异性抗体、抗血清和/或T细胞系或克隆反应的多肽。本文中，如果抗血清和抗体特异地与抗原结合(即在ELISA或其它免疫测定中它们与该蛋白质反应，而且检测不到它们与无关蛋白质的反应)，则它们是“抗原特异性的”。这些抗血清和抗体可以按本文所述并采用熟知技术制备。天然肺肿瘤蛋白质的免疫原性部分是(例如在ELISA和/或T细胞反应性测定中)以基本上不低于该全长多肽的反应性的水平与这些抗血清和/或T细胞反应的部分。这些免疫原性部分可以在这些测定试验中以类似于或高于该全长多肽的反应性的水平反应。一般可以采用本领域普通技术人员熟知的方法，例如描述于Harlow和Lane，抗体实验室手册(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988中的那些技术，进行此筛选。例如，可以将多肽固定在固相支持物上，并用患者血清与之接触以允许该血清中的抗体与该固定化多肽结合。然后除去未结合的血清，并采用例如125I标记的A蛋白检测结合的抗体。
正如以上指出的，组合物可以含有天然肺肿瘤蛋白质的变体。本文所述多肽“变体”是指与天然肺肿瘤蛋白质相差一或多个替代、缺失、添加和/或插入以致基本上保持了多肽的免疫原性的多肽。换言之，相对于天然蛋白质，变体与抗原特异性抗血清的反应能力可以有所增强或不发生改变，或可以相对于该天然蛋白质有不足50％、优选不足20％的降低。一般可以通过对一种上述多肽序列进行修饰，然后评价该修饰多肽与本文所述抗原特异性抗体或抗血清的反应性，从而鉴定这些变体。优选的变体包括其中一或多个部分，例如N端前导序列或跨膜域已经被除去的那些变体。其它优选的变体包括已从成熟蛋白质的N和/或C端除去了一个小部分(例如1-30个氨基酸，优选5-15个氨基酸)的变体。
多肽变体优选表现出(按上述方法测定)与所指定的多肽有至少约70％、更优选至少约90％、最优选至少约95％的一致性。
优选地，变体含有保守替代。“保守替代”是指一个氨基酸替代具有相似性质的另一个氨基酸，以致肽化学领域的技术人员将预期该多肽的二级结构和亲水性质基本上不发生改变。一般可以基于氨基酸残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或双亲性质，进行氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有非荷电极性头部基团、具有相似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守改变的其它氨基酸组包括(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体可以还，或作为可替代方案，含有非保守改变。在一个优选实施方案中，变体多肽与天然多肽相差5个或更少个氨基酸的替代、缺失或添加。还(或者作为可选择方案)可以通过例如缺失或添加对该多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质产生最小影响的氨基酸，修饰变体。
正如以上指出的，多肽可以在该蛋白质的N末端含有在翻译的同时或在翻译后指导该蛋白质转移的信号(或前导)序列。该多肽还可以和接头或其它序列偶联，以利于该多肽的合成、纯化或鉴定(例如poly-His)，或增强该多肽与固相支持物的结合。例如，可以将多肽与免疫球蛋白的Fc区偶联。
多肽的制备可以采用多种熟知技术中的任意一种。采用本领域普通技术人员已知的多种表达载体中的任何一种，可以容易地从本文所述的DNA序列制备这些序列编码的重组多肽。可以在任何一种用含有编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的适合宿主细胞中实现表达。适合的宿主细胞包括原核细胞、酵母、高等真核细胞和植物细胞。优选地，该宿主细胞采用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系例如COS或CHO。首先可以采用可商业购买获得的滤器，浓缩来自将重组蛋白或多肽分泌至培养基中的适合宿主/载体系统的上清液。浓缩后，可以将该浓缩物应用到适合的纯化基质例如亲和基质或离子交换树脂上。最后，可以采用一或多个反相HPLC步骤进一步纯化重组多肽。
还可以通过合成手段，采用本领域普通技术人员熟知的技术，制备具有少于约100个氨基酸、一般少于约50个氨基酸的多肽部分和其它变体。例如，可以采用任何一种商业可获得的固相技术，例如Merrifield固相合成法，通过将氨基酸顺序地添加到生长的氨基酸链上，合成这些多肽。见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。用于自动合成多肽的仪器可从供应商例如Perkin Elmer/Applied BioSystemsDivision(Foster City，CA)处购买获得，并可以按厂家说明书进行操作。
在某些具体的实施方案中，多肽可以是含有多个上述多肽的融合蛋白，或含有至少一个上述多肽及无关序列(例如已知的肿瘤蛋白质)的融合蛋白。融合伴侣(fusion partner)可以例如协助提供T辅助细胞表位(免疫学融合伴侣)，优选人类所识别的T辅助细胞表位，或可以协助使该蛋白质比该原来的重组蛋白以更高的产量表达(表达增强子)。某些优选的融合伴侣既是免疫学融合伴侣又是表达增强融合伴侣。可以选择其它融合伴侣，以便增加该蛋白质的可溶性或使该蛋白质能被导向期望的细胞内区室。再其它融合伴侣包括利于该蛋白质纯化的亲和标记物。
融合蛋白一般可以采用包括化学偶联在内的标准技术制备。优选地，将融合蛋白表达为重组蛋白质，以便使其相对于非融合蛋白在表达系统中的产生水平提高。简而言之，可以单独地将编码这些多肽成分的DNA序列组装起来，然后连接至适合的表达载体中。将编码一个多肽成分的DNA序列的3’末端与编码第二多肽成分的DNA序列的5’末端，在有或无肽接头时相连，以便这些序列的阅读框同相。这就使得可以翻译成保留了这两个多肽成分的生物学活性的单个融合蛋白质。
可以采用肽接头序列将该第一和第二多肽成分分开一段足够长的距离，以保证每一个多肽都折叠成其二级和三级结构。该多肽接头序列可以采用本领域熟知的标准技术并入融合蛋白中。可以基于以下因素选择适合的肽接头序列(1)其能够采取柔性伸展构象；(2)不能采取能与该第一和第二多肽的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可以和该多肽的功能性表位反应的疏水或带电荷残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可以用于该接头序列中。可以用作接头的有用氨基酸序列包括那些公开于如下文献中的序列Maratea等，基因(Gene)4039-46，1985；Murphy等，美国国家科学院院刊838258-8262，1986；美国专利4,935,233和美国专利4,751,180。接头序列一般可以长1-约50个氨基酸。当该第一个和第二个多肽具有能够用以分开这些功能域并防止空间干扰的非必需N端氨基酸区域时，则无需接头序列。
将这些相连的DNA序列可操作地与适当的转录或翻译调节元件连接在一起。负责DNA表达的调节元件仅置于编码该第一多肽的DNA序列的5’端。同样，终止翻译所必需的终止密码子和转录终止信号仅存在于编码该第二多肽的DNA序列的3’端。
本发明还提供含有本发明多肽及无关免疫原性蛋白质的融合蛋白。优选地该免疫原性蛋白质能够引起回忆应答。这些蛋白质的实例包括破伤风、结核和肝炎蛋白(见例如Stoute等，New Engl.J.Med.，33686-91(1997))。
在优选的实施方案中，免疫学融合伴侣来源于D蛋白，即革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的一种表面蛋白质(WO 91/18926)。优选地，D蛋白的衍生物含有该蛋白质的大约三分之一(first third)(例如N端的头100-110个氨基酸)，而且可以对D蛋白衍生物进行脂化。在某些优选实施方案中，N端包括了D脂蛋白融合伴侣的头109个残基，以提供具有额外外源性T细胞表位的多肽并增强其在大肠杆菌中的表达水平(由此起到表达增强子的作用)。该脂类尾部保证了该抗原向抗原呈递细胞的最佳呈递。其它融合伴侣包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。尽管可以采用包括T辅助细胞表位在内的不同片段，但典型地采用此N端81个氨基酸。
在另一个实施方案中，该免疫学融合伴侣是称作LYTA的蛋白质，或其部分(优选C端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，该细菌合成一种称作酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；基因(Gene)43265-292，1986)。LYTA是一种特异降解该肽聚糖骨架中某些键的自溶素。该LYTA蛋白的C端区域负责与胆碱或某些胆碱类似物例如DEAE的亲和。该性质已被利用来开发表达融合蛋白的大肠杆菌表达C-LYTA的质粒。对在氨基端含有该C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化已有描述(见生物技术(Biotechnology)10795-798，1992)。在一个优选的实施方案中，可以将LYTA的重复部分掺入融合蛋白中。重复部分存在于从第178个残基起始的C端区域中。尤其优选的重复部分包括第188-305位残基。
一般地，本文所述多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是从其最初环境中被分离出来的多肽或多核苷酸。例如，如果将天然存在的蛋白质和其自然系统中的一些或全部共存物质分开，则该蛋白质是“分离的”。优选地，这些多肽有至少约90％的纯度、更优选至少约95％的纯度，最优选至少约99％的纯度。例如，如果将多核苷酸克隆在非其自然环境一部分的载体中，则该多核苷酸被认为是分离的。结合剂本发明还提供特异地与肺肿瘤蛋白质结合的药剂，例如抗体和其抗原结合片段。在本文中，如果抗体或其抗原结合片段(在例如ELISA中)以可检测得到的水平与肺肿瘤蛋白质反应，而在相似条件下不能检测到其与无关蛋白质的反应时，则被认为与肺肿瘤蛋白质“特异结合”。本文所用“结合”是指两个独立分子之间的非共价联接以致形成复合物。结合能力可以通过例如测定形成该复合物的结合常数来评价。结合常数是当用各成分的浓度乘积除该复合物的浓度时获得的值。一般地，在本文的上下文中，当形成复合物的结合常数大于约103L/mol时，两个化合物被认为是“相结合的”。该结合常数可以采用本领域熟知的方法测定。
采用本文提供的代表性测定方法，结合剂还能够区分患者是否患有癌症，例如肺癌。换言之，与肺肿瘤蛋白质结合的抗体或其它结合剂将在至少约20％患有该病的患者中产生指示癌症存在的信号，而将在至少约90％未患该病的个体中产生指示癌症不存在的信号。为了确定结合剂是否满足此要求，可以按本文所述方法测定在来自(用标准临床检验确定的)患有和未患癌症的患者的生物样品(例如血液、血清、痰、尿和/或肿瘤活检组织)中是否存在与该结合剂结合的多肽。很明显，分析的患病和未患病样品的数量应当具有统计学显著性。每个结合剂都应满足以上标准；然而，本领域普通技术人员将知道，可以联合使用多个结合剂以提高灵敏度。
满足以上要求的任何药剂都可以是结合剂。例如，结合剂可以是含有或不含有肽成分的核糖体、RNA分子或多肽。在一个优选实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。抗体的制备可以采用本领域普通技术人员已知的多种技术中的任意一种。见例如Harlow和Lane，抗体实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，可以通过细胞培养技术制备抗体，包括按本文所述制备单克隆抗体，或通过用抗体基因转染适合的细菌或哺乳动物细胞宿主，以便使得可以产生重组抗体。在一项技术中，首先给多种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或山羊)中的任一种注射含有本发明多肽的免疫原。在该步骤中，可以将本发明的多肽不经修饰用作免疫原。或者，尤其是对于相对短的多肽，如果将该多肽与载体蛋白质，例如牛血清白蛋白或匙孔?血蓝蛋白，连接在一起，则可以引起极佳的免疫应答。给该动物宿主注射该免疫原，并优选地根据预先确定的时间表掺入一或多次加强免疫，然后定期采取该动物的血液。然后可以从抗血清中，通过例如采用与适合固相支持物偶联的该多肽进行亲和层析，纯化对该多肽具有特异性的多克隆抗体。
对目的抗原多肽具有特异性的单克隆抗体可以采用例如Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)，及其改良方法来制备。简而言之，这些方法涉及制备能够产生具有期望特异性(即与目的多肽的反应性)的抗体的永生化细胞系。可以从例如获自按上述方法免疫的动物的脾细胞制备这些细胞系。然后通过例如和骨髓瘤细胞融合伴侣，优选与该免疫动物同基因的骨髓瘤细胞，融合，使该脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将该脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度铺在支持杂种细胞而不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基上。优选的筛选技术采用了HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)筛选。在足够长的时间之后，通常为约1-2周，可观察到杂种集落。选择单集落，并测试其培养物上清液与本发明多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可以从培养的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，还可以采用各种技术增加产量，例如将该杂交瘤细胞系注射入适合脊椎动物宿主例如小鼠的腹腔内。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术例如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提从这些抗体中除去杂质。本发明多肽可以用于纯化方法的例如亲和层析步骤中。
在某些实施方案中，可能优选采用抗体的抗原结合片段。这些片段包括Fab片段，它们可以采用标准技术制备。简而言之，可以通过在A蛋白珠柱上通过亲和层析从兔血清中纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane，抗体实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后通过木瓜蛋白酶消化产生Fab和Fc片段。该Fab和Fc片段可以在A蛋白珠柱上通过亲和层析分离。
可以将本发明的单克隆抗体与一或多种治疗剂偶联在一起。在此方面适合的治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素和它们的衍生物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。优选的药物包括氨甲蝶呤、及嘧啶和嘌呤的类似物。优选的分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。优选的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、gelonin、假单孢菌外毒素、志贺氏菌毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。
治疗剂可以与适合的单克隆抗体直接或间接地(即通过接头基团)偶联(例如共价键合)。当药剂和抗体均具有能够与另一个反应的取代基时，它们之间的直接反应是可能的。例如，一个上的亲核基团，例如氨基或巯基，可以和另一个上的含有羰基的基团例如酐或酰基卤，或含有容易离去的基团(例如卤素)的烷基反应。
或者，可能期望将治疗剂和抗体通过接头基团偶联。接头基团能够作为间隔起作用使抗体和药剂分隔开，以便避免对结合性能的干扰。接头基团还可以用于增强药剂或抗体上取代基的化学反应性，由此增加偶联效率。化学反应性的增强还可以促进药剂、或药剂上功能基团的应用，否则将不可能实现这种应用。
本领域技术人员将明了，有多种功能相同和相异的双功能或多功能试剂(例如描述于Pierce化学制品公司(Rockford，IL)的产品目录中的那些)可以用作该接头基团。可以通过例如氨基、羧基、巯基或氧化糖残基实现偶联。有许多文献描述过该方法学，例如Rodwell等的美国专利4,671,958。
当治疗剂游离于本发明治疗偶联物的抗体部分而更为有效时，可能期望采用在内化进行细胞过程中或之后可切割的接头基团。已有过许多不同的可切割接头基团的描述。在细胞内从这些接头基团处释放出药剂的机制包括由二硫键还原(例如Spitler的美国专利4,489,710)、光不稳定键的辐射(例如Senter等的美国专利4,625,014)、衍生的氨基酸侧链的水解(例如Kohn等的美国专利4,638,045)、血清补体介导的水解(例如Rodwell等的美国专利4,671,958)、和酸催化的水解(例如Blattler等的美国专利4,569,789)引起的断裂。
可能期望将一个以上的药剂与抗体偶联。在一个实施方案中，一个药剂的多个分子与一个抗体分子偶联。在另一个实施方案中，一种以上类型的药剂可以和一个抗体偶联。无论具体的实施方案如何，可以有多种途径制备带有一个以上药剂的免疫偶联物。例如，可以将一个以上的药剂直接与一个抗体分子偶联，或可以采用提供多个连接位点的接头。或者，可以采用载体。载体可以以多种方式携带这些药剂，包括直接或通过接头基团的共价键合。适合的载体包括蛋白质例如白蛋白(例如Kato等的美国专利4,507,234)、肽和多糖例如氨基葡聚糖(例如Shih等的美国专利4,699,784)。载体还可以通过非共价结合或通过包入例如脂质体囊中(例如美国专利4,429,008和4,873,088)携带药剂。特异用于放射性核素药剂的载体包括放射性卤化小分子和螯合化合物。例如美国专利4,735,792公开了代表性的放射性卤化小分子和它们的合成。可以从螯合化合物形成放射性核素螯合物，这些螯合化合物包括那些含有氮和硫原子作为结合金属、或金属氧、放射性核素的供体原子的螯合化合物。例如，Davison等的美国专利4,673,562公开了代表性的螯合化合物和它们的合成。
可以采用多种途径施用这些抗体和免疫偶联物。典型地，可以静脉内、肌内、皮下或在切除肿瘤床(bed of a resected tumor)中给药。很明显，该抗体/免疫偶联物的精确剂量将随所用的抗体、肿瘤上的抗原密度、和抗体的清除率而改变。T细胞免疫治疗组合物可以还，或者作为替代方案可以，含有肺肿瘤蛋白质特异性T细胞。这些细胞一般可以在体外或离体采用标准程序制备。例如，可以采用商业上可获得的细胞分离系统，例如可从NexellTherapeutics公司(Irvine，CA)获得的IsolexTM系统，从患者的骨髓、外周血、或骨髓或外周血组分分离T细胞(也参见美国专利5,240,856；美国专利5,215,926；WO89/06280；WO91/16116和WO92/07243)。或者，可以从相关或无关的人、非人哺乳动物、细胞系或培养物获得T细胞。
可以用肺肿瘤多肽、编码肺肿瘤多肽的多核苷酸和/或表达该多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。该刺激在足以产生对该多肽特异的T细胞的条件和时间下进行。优选地，将肺肿瘤多肽或多核苷酸置于递送载体中，例如微球体中，以利于特异性T细胞的产生。
如果T细胞特异增殖、分泌细胞因子或杀伤被覆肺肿瘤多肽或表达编码该多肽的基因的靶细胞，则该T细胞被认为是肺肿瘤多肽特异的。T细胞的特异性可以采用多种标准技术中的任一种进行评价。例如，在铬释放测定或增殖测定中，相对于阴性对照，在裂解和/或增殖方面超过2倍的刺激指数增加指示T细胞的特异性。这些测定可以按例如Chen等，癌症研究(Cancer Res.)541065-1070，1994中的描述进行。或者，可以通过各种已知技术检测T细胞的增殖。例如，可以通过测量DNA合成速率的增加(例如通过用含氚胸苷脉冲标记T细胞培养物并测量掺入DNA中的含氚胸苷的量)，检测T细胞的增殖。和肺肿瘤多肽(100ng/ml-100μg/ml，优选200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天应导致T细胞增殖的至少2倍增加。正如采用标准细胞因子测定方法所测量的，在该测定方法中细胞因子(例如TNF或IFN-γ)释放水平增加2倍指示T细胞的激活(见Coligan等，当代免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)，第1卷，Wiley Interscience(Greene 1998))，按以上所述接触2-3小时应导致T细胞的激活。响应肺肿瘤多肽、多核苷酸或表达该多肽的APC而激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+的。可以采用标准技术扩增肺肿瘤蛋白质特异性T细胞。在优选的实施方案中，这些T细胞来源于患者、或相关或无关的供体，并在刺激和扩增后被用于该患者。
对于治疗目的，可以在体外或体内扩增响应肺肿瘤多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T细胞的数量。可以有多种途径来实现这些T细胞的体外增殖。例如，可以在添加了或未添加T细胞生长因子(例如白介素2)和/或合成肺肿瘤多肽的刺激细胞的情况下，将这些T细胞重新暴露于肺肿瘤多肽或相应于该多肽免疫原性部分的短肽中。或者，可以通过克隆大量扩增在存在肺肿瘤蛋白质时增殖的一或多种T细胞的数量。克隆细胞的方法是本领域所熟知的，包括有限稀释。药物组合物和疫苗在某些方面，可以将本文所公开的多肽、多核苷酸、T细胞和/或结合剂掺入药物组合物或免疫原性组合物(即疫苗)中。药物组合物含有一或多种这些化合物及生理学上可接受载体。疫苗可以含有一或多种这些化合物和免疫刺激剂。免疫刺激剂可以是增强或加强针对外源性抗原的免疫应答的任何物质。免疫刺激剂的例子包括佐剂、生物可降解微球体(例如polylactic galactide)和脂质体(所述化合物被掺入其中；见例如Fullerton，美国专利4,235,877)。疫苗的制备一般描述于例如M.F.Powell和M.J.Newman编，“疫苗的设计(亚单位和佐剂方法)(Vaccin