专利名称：用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置的制作方法本发明的如下图1为本发明的结构示意图；图中1.机体；2.不锈钢网状隔板；3.固定夹；4.加热器；5.氧气口；6.温控钮；7.温度监视器；8.调速钮；9.电源开关；10.蠕动泵；11.无菌输入导管；12.无菌输出导管；13.针柄；14.灌流针；15.不锈钢滤网；16.导氧管；17.灌流瓶；18.充氧器；19.侧孔；20.输氧管。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明如图1所示，一种用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置，其特征在于机体1上设置有容器，容器内设置有不锈钢网状隔板2，位于不锈钢网状隔板2下方的容器底部设置有加热器4，带有侧孔19的灌流瓶17通过固定夹3定位于不锈钢网状隔板2上表面处，灌流瓶17顶部通过支架固定有不锈钢滤网15，设置于机体1上的蠕动泵10输入端与无菌输入导管11连通，蠕动泵10输出端通过无菌输出导管12、针柄13、灌流针14连通。本实验新型的工作原理是这样的向机体1上的容器内加入蒸馏水，并通过加热器4把水加热至37℃，以保证在37℃的恒定温度下进行全部操作。首先，在无菌条件下，以手术方法获取动物肝脏或正常人供肝组织，稍加外表修整和冲洗后，放在无菌不锈钢筛网15上，灌流瓶17的容积是500～1000ml。将无菌输入导管11先与装有充氧前灌流液的容器相连通，充氧前灌流液是含EDTA、无Ca2+及Mg2+离子的Hanks液，将灌流针14与放于无菌不锈钢筛网15上的动物肝脏或正常人供肝组织中的门静脉或肝动脉相连通。开启蠕动泵10，以80～100ml/分钟的速度将500～800ml、37℃的充氧前灌流液灌入肝脏，灌入肝脏的充氧前灌流液自肝门血管溢出，滴入灌流瓶17内，时间约10～15分钟。此为第一步灌流，主要采用恒温、匀速灌流方法，通过37℃的前灌流液冲洗肝内血液，使残留红细胞尽可能冲干净，为酶消化做准备。
其次，移弃灌流瓶17内的充氧前灌流液及其它残留红细胞等杂质，用无菌缓冲液洗净后，向灌流瓶17内加入浓度为0.05％的胶原酶液100～250ml。将无菌输入导管11经灌流瓶17侧孔与灌流瓶17内的胶原酶液相连通，灌流针14仍与肝脏门静脉或肝动脉相连通，开启蠕动泵10，以50～70ml/分钟的灌速匀速循环灌注肝脏，10分钟后结束灌流。此为第二步肝灌流，主要通过向肝内循环灌注胶原酶，消化分解肝细胞之间的纤维连接，分离肝细胞。
经过灌流的动物肝脏或正常人供肝组织置于灌流瓶17内，用剪刀划破肝包膜，剔除胆囊和大块纤维结缔组织，振荡灌流瓶17，继续消化肝组织10～15分钟，用培养液终止消化。收集肝细胞悬液，用200目钢网进行过滤，然后转移至离心管低速离心即可得到所需肝细胞。
综上所述，本发明为一肝灌流消化分离肝细胞的装置，以体外两步胶原酶灌流法为基本原理，通过该装置可获得高质量的肝细胞，用于实验研究或应用研究，尤其可用于需要大量肝细胞的应用与临床研究用途。
如图1所示，为了降低肝细胞的缺氧时间，减少肝细胞内空泡，提高肝细胞的活力，可以对灌流液进行充氧处理，即设置于机体1上的充氧器18输入端通过输氧管20与位于机体上氧气口5连通，充氧器18输出端通过导氧管16经灌流瓶17侧孔与灌流瓶17内连通。
如图1所示，蠕动泵10的调速钮8和电源开关9均可以设置于机体10上。如图1所示，机体1上可以设置有监测容器内温度的温度监视器7。如图1所示，加热器4的温控钮6可以设置于机体1上。
一种用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置，其特征在于机体上设置有容器，容器内设置有不锈钢网状隔板，位于不锈钢网状隔板下方的容器底部设置有加热器，带有侧孔的灌流瓶通过固定夹定位于不锈钢网状隔板上表面处，灌流瓶顶部通过支架固定有不锈钢滤网，设置于机体上的蠕动泵输入端与无菌输入导管连通，蠕动泵输出端通过无菌输出导管、针柄、灌流针连通。它可以对离体肝脏进行两步肝灌流，最大限度地快速、连续进行前灌流液和消化液的有效灌注，最大程度地质控消化肝组织过程，节约成本，恒定温度，减少污染，从而保质保量的获得实验与临床所用的肝细胞，尤其是肝细胞移植、生物人工肝等所需的大量肝细胞。
用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置制作方法
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