专利名称：一种快速获得三倍体枇杷的方法枇杷属蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Mriobotrya)植物,原产我国，栽培品种为普通枇杷(E. 已有2100多年的栽培历史(章恢志,彭抒昂，蔡礼鸿,等.中国枇杷属种质资源及普通枇杷起源研究.园艺学报，1990，(1):5 11;邱武陵，章恢志.中国果树志 (龙眼、枇杷卷).北京中国林业出版社，1996 ;黄金松.枇杷栽培新技术.福建福建科学技术出版社，2000)。我国枇杷资源丰富，分布区遍及北纬33.5°以南的19个省(直辖市、 自治区)。枇杷秋萌冬花，春实夏熟，在百果中独具先天四时之气，被誉为独冠时新的佳果珍味。枇杷成熟期正值水果淡季，且果肉柔软多汁，营养丰富，风味佳美，并具有化痰润肺之功效。枇杷全身都是宝，除供鲜食外，还可以制罐、果膏、果汁、果露及酿酒，深受人们喜爱。发展枇杷业对调整农业产业结构和增加农民收入起着重要作用。随着对枇杷深加工及其综合利用的加强，其深度开发意义深远。但由于枇杷果实种子较多，可食率相对较低，所以获得无籽枇杷果实是人们梦寐以求的愿望。尤其是近年来枇杷成为商品价值高的水果后，无籽果的生产要求愈来愈突出。它不仅可以增加可食率、提高果实的商品价值，还可以避免授粉受精不良或冬季低温冻害而造成的减产。但是，枇杷所固有的基因高度杂合与童期长等特点使常规育种方法受到较大限制，为此数十年来，国内外学者对无籽枇杷的研究主要集中在采用生长调节剂来诱导枇杷的单性结实(丁长奎，章恢志.植物激素对枇杷果实生长发育的影响.园艺学报，1988，15(3):148 154; 丁长奎，陈其峰，夏起洲，等.生长调节剂对枇杷成熟期和品质的影响.中国果树，1989 (I) : 13 15 ;Chaudhary, A. S. Singh, M. Singh, C. N. Effect of plant growth regulatora on maturity of loquat iBriobotrya japonica Lindl). Progress Hort, 1990，22:184 190 ;Chaudhary, A. S. Singh, M. Singh, C. N. Effect of NAA , 2, 4, 5-T and GA on loquat cultivar iSafeda Batiaj . India J. Agr. Res., 1993，28:127 132 ;蒋际谋，郑少泉.‘长红3号’枇杷喷布生长调节剂的效应.福建果树， 1998 (2)13 14 ;张谷雄，康丽雪，高志红，朱顺莲，高凯碧.GA和CPPU对枇杷无核果品质的影响·果树科学，1999，16 (1):55 59 ;Wu J, Lin S. Effect of naphthaleneacetic acid on fruit in iJie fang zhong’ loquat. Liacer G, Badenes M L. Serie A: Seminaires Mediterraneens, NO. 58, Option Mediterraneens. Zaragoza: Instituto Agronomico Mediterraneo de Zaragoza, 2003. 109 112 ;陈俊伟，冯健君，秦巧平，刘晓坤，吴江，谢鸣.GA3诱导的单性结实‘宁海白’白沙枇杷糖代谢的研究.园艺学报，2006， 33 (3) :471 476)。虽然人工合成的生长调节剂在诱导西瓜(Citrullus vulgaris)、 番石槽(Psidium guajava)、番木瓜(Carica papaya)、油梨(Persea americana)、葡萄 (Vitis vinifera)、祀果(Mangifera indica)等产生无籽果实取得成功(Wong C Y(黄昌贤)·Induced parthenocarpy of watermelon, cucumber and pepper by the useof growth promoting substances . Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 1938, 36:632 636 ；Luckwill L C.The hormones content of the seed in relation endosperm development and fruit drop in the apple. J Hort Sci, 1948，24:32 44 ;黄昌贤·番木瓜的单性结果和单性结子问题.植物生理学通讯，1957 (2) 61 65 ；Crane J C. The chemical induction of parthenocarpy in the Calimyrna fig and its physiological significance. Plant Physiol, 1965，40:606 610),开创了人工刺激单性结实的历史,但在枇杷上诱导结实均不理想，无论在花前、花后不同时期喷布赤霉素或赤霉素结合其它生长调剂物质(NAA、BA、CPPU、MH)，其结果都只能得到细长的无籽果实，或品质不好有种子的果实，而且无籽果的获得率低下，效果不稳定，不具有商品价值(丁长奎，章恢志.植物激素对枇杷果实生长发育的影响.园艺学报，1988，15 (3) :148 154;盛宝龙，吴伟民.无核枇杷生产技术研究.中国南方果树，1998，27 (5) :3 6 ;张谷雄，康丽雪，高志红，朱顺莲， 高凯碧.GA和CPPU对枇杷无核果品质的影响.果树科学，1999，16 (I) :55 59 ;张泽煌， 郑少泉，刘友接，许秀淡，许家辉，蔡际谋，陈秀萍.无籽枇杷研究初报.亚热带植物科学， 2002,31 (1):9 13 ;陈俊伟，冯健君，秦巧平，刘晓坤，吴江，谢鸣.GA3诱导的单性结实‘宁海白’白沙枇杷糖代谢的研究·园艺学报，2006,33 (3) :471 476)。要想获无籽枇杷，最主要同时也是最有效的方法则是选育出三倍体，利用三倍体的特性获得无籽枇杷果实和新品种。福建农业科学院果树研究所于1978年用秋水仙素处理‘太城4号’枇杷，再结合6tlCo-Y射线进行诱变，获得四倍体枇杷‘闽3号’，在花期用GA 处理成功获得了无籽枇杷果实(郑少泉，许秀淡.枇杷辐射诱变育种研究I .枝条辐射的适宜剂量及性状变异.中国南方果树，1996，25 (3) :25 27)，虽然肉厚，可食率高，单核多，但产量低，很难直接在生产上应用(郑少泉，许秀淡，蒋际谋等.枇杷品种与优质高效栽培技术原色图说.北京中国农业出版社，2005:1 16)。我国学者已相继在枇杷胚乳培养方面获得了完整植株，经检查其根尖细胞染色体数目为接近三倍体的非整倍体植株(陈振光，林顺权，林庆良.枇杷胚乳培养获得植株试验初报.福建农学院学报，1983，12 (4) 343 345 ;林顺权.枇杷胚乳离体培养获得植株的研究.福建农学院学报，1985，14 (2) 115 117;彭哓军，王永清.枇杷胚乳愈伤组织诱导和不定芽发生的研究.四川农业大学学报，2002，20 (3) :189 192)。利用胚乳培养获得三倍体植株是培养无籽枇杷的可能途径，但至今仍未见其生长结果的进一步报道。最富成效的是日本农业综合研究中心暖地园艺石开究所的Muranishi (Muranishi S. Effect of gibberellic acid (GA ) on the seedless fruiting of artificial polyploids in loquats (Briobotrya japonica Lind. L). Acta Horticulturae, 1982，137:343 347)与八幡茂木(八幡茂木.生产无核枇杷的新途径一一利用三倍体.许建国译.柑桔与亚热带果树信息，1999，(6):32 33)，他们利用在葡萄等果树上常用的三倍体技术，从上世纪80年代开始，以千叶县代表性同源四倍体品种 ‘田中’ (Tanaka)为母本，回交二倍体亲本，从200个株系筛选出一个最优株系‘希房’，但枇杷单性结实能力弱，无籽果实发育不良，三倍体几乎都在开花后脱落。因此必须结合激素的使用，才可获得具商品价值的果实，此果实不会混杂有种子的果实，而且所用植物生长调节剂的浓度低，具有经济栽培价值。从而使日本在三倍体杂交育种方面处于世界领先地位。但杂交育种存在年限长，需要有四倍体亲本供体，同时该四倍体亲本还要具有良好的育性，此外，该三倍体枇杷还存在一些不足首先是商品化率不高(只有60%左右)，其次与有籽果实相比，果实品质还是欠佳，有待进一步筛选亲本材料以及结合相应的栽培管理措施。国内在这方面的研究尚未见报道。综上所述，目前已经有学者尝试利用三倍体培育无籽枇杷果实或植株，但是其周期长、数量少、效率低，而且果实品质不佳，因此快速获得三倍体枇杷的方法具有重要的实际应用价值，但国内外尚未见相关研究报道。发明目的鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种快速获得三倍体枇杷的方法，其最大的优点就是快速、高效，能够在短期内获得大量的三倍体枇杷植株，为无籽枇杷新品种的选育打下坚实的基础。1993年，在进行“四川枇杷属种质资源调查与评价”研究时，首次发现枇杷种子独特的遗传规律——高频产生三倍体的现象。1997年本发明申请人对四川主要栽培品种进行了染色体系统研究，又发掘出不同比率的天然三倍体，经重复检查，均属纯合三倍体，生长正常。之后,本发明申请人开始了大量生产三倍体枇杷的研究。本发明所述的一种快速获得三倍体枇杷的方法，主要通过对枇杷种子进行根尖染色体检测从而筛选获得三倍体，依次通过以下步骤实现(1)收集枇杷种子，于20°c恒温萌发催芽；(2)待枇杷根长至1-2厘米时，取根尖用浓度为O.002摩尔/升的8-羟基喹啉水溶液避光浸泡处理3小时，播种取了根尖的种子；(3)处理后的根尖用卡诺氏固定液浸泡处理2-24小时，卡诺氏固定液为甲醇冰醋酸体积比=3:1的混合液；(4)切取1-2毫米根尖，用蒸馏水清洗后，用浓度均为O.03克/毫升的纤维素酶与果胶酶混合酶液浸泡处理3小时；(5)根尖用蒸馏水浸泡10分钟，然后用卡诺氏固定液固定，卡诺氏固定液为甲醇冰醋酸体积比=3:1的混合液；
(6)将固定好的根尖均匀涂抹在载玻片上，用磷酸缓冲液(0.01克/毫升的磷酸氢二钠溶液0. 01克/毫升的磷酸二氢钾溶液体积比=6 4的混合液)稀释的体积比浓度为5% 的Giemsa染色液染色，显微镜检查染色体数目，确定根尖对应的三倍体种子；
(7)将三倍体种子进行常规栽培管理，即得到三倍体枇杷植株。


图I为实生筛选获得的天然三倍体枇杷幼苗及其体细胞染色体数目(2n=3x=51) 本发明的优点或积极效果
传统的三倍体选育技术周期长(要获得三倍体枇杷，杂交育种一般至少6年)、效率低、 成本高、得到三倍体数量较少。利用本发明方法筛选得到的三倍体数量多，比例大，平均达到O. 406%,且不需要特殊的仪器设备，操作简单，容易掌握，工作效率较高，平均每人每天能够检测200-300颗种子，大大提高了枇杷三倍体育种的效率。该发明具有快速(当天即可确定三倍体种子)、高效和一步获得大量三倍体枇杷的优点。

实施例现在对本发明进行进一步详细说明，利于达到最佳效果，但不是对本发明的限制， 本领域技术人员可以对其进行相应的改良。(I)准备河沙，用高压灭菌锅在121°C下高温高压消毒20分钟，降温至室温备用；
(2)准备带透气孔的塑料箱，将消毒后备用的河沙用清水拌湿，以用手捏沙能成团但又不出水为宜，然后将拌好的河沙铺在塑料箱中，整理松软平整，厚度约为15-20厘米；
(3)收集枇杷种子，用清水洗净，然后用100毫克/升的多菌灵溶液浸泡10分钟，再用清水漂洗I 一 2次备用；
(4)将准备好的种子逐粒播种于塑料箱中的河沙里，种脐朝下，播种深度为种子高度的三分之二，然后在上面加一层塑料沙网，再铺上1-2厘米厚消毒备用的河沙，置于20°C的室内，保湿萌发催芽；
(5)大约一周左右，种子开始萌发长出新根，当根长至1-2厘米时，用医用镊子夹取根尖部分(长度约5毫米)，放入装有浓度为O. 002摩尔/升的8-羟基喹啉水溶液的I. 5毫升离心管中，将夹取根尖的种子依次播种于装有已消毒处理河沙的穴盘中，穴盘中的种子编号与离心管中根尖编号对应，将装有根尖的离心管置于20°C避光浸泡处理3小时；
(6)前一步处理时间达到3小时后，用胶头滴管吸出离心管中的8-羟基喹啉溶液，加入新配制的卡诺氏固定液(甲醇冰醋酸体积比=3:1)处理2-24小时；
(7)待前一步处理结束，将固定液吸出，并用刀片切取根尖(长度1-2毫米)放入I.5 毫升离心管中，用无菌蒸馏水反复清洗2-3次，加入浓度均为O. 03克/毫升的纤维素酶与果胶酶混合酶液20微升处理3小时；
(8)待前一步处理结束，轻轻吸出酶液，保证根尖不散碎，用无菌蒸馏水浸泡根尖10分钟，然后轻轻吸出蒸馏水，加入新鲜配制的卡诺氏固定液(甲醇冰醋酸体积比=3:1)；
(9)用尖嘴眼科镊子轻轻夹出根尖，在载玻片上快速涂抹，直到根尖成细微糊状，然后滴上少许卡诺氏固定液，向载玻片表面轻轻吹气，迅速在酒精灯上烘烤1-2秒钟；
(10)准备干净的玻璃板，放置两根干净直径约I毫米的竹棍，将制备好的载玻片放于竹棍上，涂抹面朝下，加入用磷酸缓冲液(O. 01克/毫升的磷酸氢二钠溶液0. 01克/毫升的磷酸二氢钾溶液体积比=6 4)稀释的体积比浓度为5%的Giemsa染色液染色5_10分钟， 用自来水冲洗干净，空气晾干；
(10)根据所取根尖的编号，在载玻片上进行标记，然后利用显微镜检查，统计染色体数目，鉴定筛选出所需要的三倍体个体；
(11)根据对应的编号，找出三倍体种子，进行常规栽培管理，从而获得三倍体植株。1997-2007年，利用本发明方法对国内22个主栽品种和日本引进的5个品种的 63472粒种子进行了检测，成功获得258株三倍体突变体，其平均频率为O. 406% (如表I)。表I 27个枇杷品种的天然三倍体检出频率


一种快速获得三倍体枇杷的方法，通过将枇杷种子催芽、取尖用8-羟基喹啉水溶液避光浸泡处理、卡诺氏固定液浸泡处理、纤维素酶与果胶酶混合酶液浸泡处理、卡诺氏固定液固定后，涂抹于载玻片上，显微镜检查染色体数目，确定根尖对应的三倍体种子。利用本发明方法筛选得到的三倍体数量多，比例大，平均达到0.406％，且不需要特殊的仪器设备，操作简单，容易掌握，工作效率较高，大大提高了枇杷三倍体育种的效率。该发明具有快速(当天即可确定三倍体种子)、高效和一步获得大量三倍体枇杷的优点。