专利名称：恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗的制作方法涉及基因工程技术。我国恶性肿瘤在城市地区发病率居死因第一位，在农村居第二位，严重威胁人民健康和生命。近年，肿瘤疫苗在肿瘤防治上已显示出一定效果，世界各国都在积极开展肿瘤疫苗研制，有的已进入临床试验，但由于种种原因，如肿瘤疫苗中的核心部分-抗原不理想、肿瘤疫苗中的辅助部分-免疫佐剂不理想、由于MHC限制及肿瘤异质性及长期以来，肿瘤疫苗制备工艺缺乏现代工程技术(例如纳米技术)的渗透和开拓，致使一些困难问题，例如，疫苗的靶向性问题，抗原的有效递呈问题，疫苗的缓释问题等尚未得到解决。本发明应用基因工程技术，制备MAGE1-Hsp-MAGE3融合蛋白和SEA的组合物，再以纳米技术构建肿瘤纳米疫苗可达到使用安全，抗瘤广谱，免疫持久，活化CD4+T细胞、CD8+T细胞，共同参与免疫反应，有效杀伤肿瘤细胞，最终实现恶性肿瘤患者手术切除肿瘤后控制复发和转移，降低死亡率的目的。本发明的优点(1)使用安全；(2)抗瘤广谱；(3)杀瘤效果强；(4)有一定靶向性；(5)使用简便(皮下注射)。本发明的技术方案选用肿瘤特异性共有抗原基因(黑色素瘤抗原1:MAGE1、黑色素瘤抗原3:MAGE3)与生物免疫佐剂热休克蛋白(Hsp)基因，将两种基因连接，构成融合基因(MAGE1-Hsp-MAGE3)，通过细菌表达，获得其融合蛋白，经最新复性、纯化技术，得到良好活性的蛋白，然后，将此蛋白与超抗原SEA(葡萄球菌肠毒素A)以一定比例组合，形成复合抗原物，最后，应用纳米技术，制备纳米脂质体，包裹复合抗原物，再通过N-羧基琥珀酰亚胺脂与Hsp连接，形成N-Hsp，将其插入纳米脂质体磷脂膜外层，即构成肿瘤纳米疫苗。本发明的具体实施步骤1．肿瘤特异性共有抗原基因的选择，克隆，质粒构建和原核表达抗原基因1:MAGE-1。抗原基因2:MAGE-3。根据MAGE-1、MAGE-3核苷酸序列，设计加酶切位点的引物，利用RT-PCR从肿瘤细胞内分别扩增MAGE-1和MAGE-3 cDNA，克隆入测序载体和表达载体，分别进行测序和原核表达，分别提取表达产物，亲和层析纯化，SDS-PAGE鉴定。2．Hsp70表达载体的构建及表达产物鉴定从Hsp70质粒(Hsp70)中PCR扩增Hsp cDNA，构建Hsp表达载体，常规方法原核表达，提取表达产物，亲和层析纯化，SDS-PAGE鉴定。3．选择可活化CD4+T细胞抗原，已有SEA纯品，可供使用。4．融合基因的构建根据文献及计算机软件分析，设计MAGE-1、MAGE-3、Hsp70三片段连接方式，分析柔性、疏水性、抗原性和表位状况。设计引物，PCR扩增，连接，获得MAGE1-Hsp70-MAGE3片段，克隆入测序载体，测序，筛选核苷酸正确的阳性克隆备用。5．融合基因表达载体的构建测序载体中酶切出MAGE1-Hsp70-MAGE3，克隆入表达载体质粒，测序。6． 融合基因的表达及鉴定7． 蛋白表达产物的纯化、变性、复性及蛋白水平检测8． 融合蛋白功能分析以亲和印迹分析或免疫斑点分析融合蛋白免疫学特征；以融合蛋白与相关肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMC)共同培养，诱导CTL，以FACS或免疫细胞化学法检测特异性CTL表面标志；M51Cr释放试验检测杀伤状况。9 ．MAGE1-Hsp70-MAGE3与SEA的组合；从产SEA标准菌株FRI100提取SEA或购得SEA纯品，以融合蛋白与SEA混合，构成融合蛋白/SEA组合物，即复合抗原。10．肿瘤纳米疫苗的构建；应用超声技术制备空白脂质体；利用空白脂质体包裹MAGE-1、MAGE-3和SEA复合抗原物，形成纳米脂质体疫苗。检测纳米脂质体的粒径。本发明恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗的体内外免疫学特性实验；(1) 体外试验靶向性a．连续排除法分离外周血树突状细胞(DC)体外培养，获得DC；b．分组试验DC+纳米疫苗DC+融合蛋白，DC+培养液以上培养30分钟，应用FACS和免疫细胞化学方法观察纳米疫苗的靶向性。杀伤性a．DC+纳米疫苗，培养4h；b．将该DC+PBMC，培养10～4d，得CTL；c．以相关肿瘤细胞(如肝癌HHCC等)为靶细胞+CTL，应用51Cr释放法，观察杀伤状况。(2)体内试验a．荷人肿瘤鼠模型的建立应用移植人HLA-A2配型外周血单个核细胞技术建立人化SCID鼠(SCID-hu)。
(注我国HLA-A2阳性人群达50％以上。)b．分组(a)SCID鼠皮下移植肝癌细胞SCID鼠皮下移植胃癌细胞SCID鼠皮下移植乳腺癌细胞(b)SCID-hu鼠皮下移植肝癌细胞SCID-hu鼠皮下移植胃癌细胞SCID-hu鼠皮下移植乳腺癌细胞(c)先分别给若干SCID-hu鼠一侧皮下注射纳米疫苗，两周后在同一区域及对侧皮下各移植肝癌细胞、胃癌细胞及乳腺癌细胞。


恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗,涉及基因工程技术,肿瘤疫苗在肿瘤防治上已显示出一定效果。本发明选用肿瘤特异性共有抗原基因(黑色素瘤抗原1:MAGE1、黑色素瘤抗原3:MAGE3)与生物免疫佐剂热休克蛋白(Hsp)基因,将两种基因连接,制备MAGE1－Hsp－MAGE3融合蛋白和SEA的组合物,再以纳米技术构建成肿瘤纳米疫苗,可达到使用安全、简便,抗肿瘤广谱、免疫持久,有效杀伤肿瘤细胞,降低死亡率的目的。