专利名称：一种防止拜氏梭菌菌株退化的方法在分解糖产酸的梭状芽孢杆菌属种，有一些种类的细菌可以在一定条件下在生长后期产中性溶剂(丙酮acetone、丁醇butanol、乙醇ethanol，常被称为ABE)。 1861年巴斯德首次发现细菌可以产生丁醇，1912年^ieizmann发现梭菌Clostridium acetobutylicum可以转化淀粉产生丙酮、丁醇、乙醇，1990年以前这些细菌被统称为产丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，后来通过16s rRNA等进一步分类，分出其他3种生长条件相同、产溶剂种类产量类似的C. beijerinckii，C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum.这也就是主要产溶剂的四种梭菌，属于梭状芽孢杆菌属(Clostridium)。目前主要的丙酮丁醇发酵菌株为丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC824和拜氏梭菌C. beijerinckii NCIMB8052,并且这两株菌的全基因组序列分别于 2001年和2007年测定完成。近年来，利用厌氧梭菌发酵法生产生物丁醇作为很有潜力的液体燃料成为研究热点。拜氏梭菌，革兰氏阳性细菌，严格厌氧，可利用普通淀粉(玉米、小麦、谷类等)、 糖类作为发酵底物进行厌氧发酵产溶剂，一般来讲，定量发酵中，ABE产量(12-20g/L)为 20-30%丙酮，60-70%丙醇和10%的乙醇。其代谢过程过程分为2个阶段产酸阶段，此阶段产酸途径被激活，乙酸、丁酸、ATP、H2, CO2为主要代谢产物，培养基的pH从6. 3迅速下降至4. 5。产酸阶段细胞将游离有机酸分泌至胞外，当培养基中的游离有机酸浓度与电离的酸根离子达到平衡，培养基的缓冲能力降低，细胞生长受到一定抑制；细胞进入芽孢生长期的同时也进入产溶剂阶段，培养基中的游离有机酸被重新吸收进细胞内合成为丙酮和丁醇。 溶齐Ll产生过禾呈主要由 acetoacetyI-CoA :acetate/butyrate_coenzymeA transferase (CoA transferase)禾口胃 ftk JL 禾中 butyraldhyde/butanol dehydrogenase, acetoacetate decarboxylase所催化。细胞从产酸代谢向产溶剂代谢的转变，芽孢形成与溶剂产生的关联和调控是目前产溶剂代谢途径研究的热点问题，对产溶剂期相关酶的增强转录及诱导表达及产酸期相关酶的抑制的机制和途径被认为是这个转折点的关键。在产溶剂梭菌的厌氧发酵过程中的菌株退化(degeneration)是目前研究的一个重要方面，也是限制其规模发酵的一个重要因素，其表现为在连续传代中菌株完全或者部分丧失了产溶剂的能力，并且是不可逆的。细胞一直处于产酸生长期，胞外积累大量的有机酸，细胞不能进入产溶剂期，这些有机酸没有被重新吸收转化，过量的有机酸使得细胞中毒死亡。在C. acetobutylicum ATCC824中，大质粒pSOLl上含有产溶剂期相关酶基因(aad、ctfA, ctfB)，连续培养中该质粒的丢失被认为是造成菌株退化的直接原因，退化菌株C. acetobutylicum中外源表达这些基因则可恢复丁醇的产量达野生型的50%左右；在C. beijerinckii NCIMB8052中也出现不可逆的菌株退化、不产溶剂现象的出现，但是C. beijerinckii NCIMB8052细胞中并没有大质粒，所有的与产溶剂相关的基因都位于基因组上；同时退化的C.beijerinckii NCIMB8052菌株中可以检测到产溶剂期相关酶基因序列的存在。因此，不同的产溶剂梭菌具有不同的控制产溶剂退化的机制，而在 C.beijerinckii NCIMB8052中这个调控机制是未知的，因此迫切需要研究其菌株退化发生机制，并找出有效控制菌株退化的方法。目前的研究并没有关于C. beijerinckii菌株退化机制的相关报道，并且对于已发生退化的菌株并没有有效的技术手段使其恢复产溶剂代谢的能力。
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种防止拜氏梭菌菌株退化的方法，以C. beijerinckii NCIMB8052位研究对象，人工获得退化菌株模型，研究退化菌株的代谢，并通过碳酸盐来调节细胞外游离的有机酸的浓度来恢复退化菌株产溶剂的能力。—种防止拜氏梭菌菌株退化的方法，按照如下步骤(1)构建退化菌株模型；(2)恢复退化菌株产丁醇代谢。所述步骤(1)构建退化菌株模型的是指C. beijerinckii NCIMB8052 野生菌株芽孢悬浮液 150 μ 1 于 75°C 热激 lOmin，然后接种至IOml TGY液体培养基，其中TGY液体培养基包括3%胰蛋白胨，2%葡萄糖，1 %酵母粉，0. 半胱氨酸，厌氧培养箱内30°C培养过夜；10%的培养物转接量进行连续转接， 每他一次，转接至IOml的新鲜TGY液体培养基中，共计转接50次，获得退化菌株，命名为 DG150 ；保存DG150的培养物，采用25%甘油保存法，_80°C 的转接量转接DG150培养物至P2发酵培养基，其中P2发酵培养基60g/L葡萄糖，lg/L酵母粉，1 % buffer, 1 % Vitamin, 1 % Mineral，厌氧培养箱内30°C进行发酵，每隔1 取样、共计发酵72h，使用分光光度计测定细菌的0D·，同时样品离心取上清进行丁醇、丙酮、乙醇、乙酸、丁酸的GC分析。所述步骤( 恢复退化菌株产丁醇代谢是指2g/L CaCO3, (NH4) 2C03，NH4HCO3, K2CO3, NaHCO3, Na2CO3 加入至 P2 发酵培养基，6%转接量转接DG150培养物至P2培养基，连续培养72h，每隔12小时取样，细菌OD6tltl的测定、样品前处理和分析方法同步骤(1)；恢复退化菌株产丁醇代谢的添加物CaCO3的使用浓度确定对CaCO3 的使用浓度进行了实验，分别有 Og/L CaCO3、2g/LCaC03、4g/L CaC03、6g/L CaC03、8g/L CaCO3, lOg/L CaCO3,发酵P2培养基、细菌OD6tltl的测定、取样方法、丁醇、丙酮、乙醇、乙酸、丁酸的分析方法同步骤(1)。所述步骤(1)中1 % buffer 包括 50g/L KH2PO4,50g/L K2HPO4,220g/L 乙酸铵， Vitamin包括0. lg/L对氨基苯甲酸、0. lg/L硫胺素、0. 001g/L生物素；Mineral包括 20g/L MgSO4· 7H20、lg/LMnS04 · H20、lg/L FeSO4 · 7H20、lg/L NaCl。退化菌株模型C. beijerinckii DG150的生长缓慢，最高OD6tltl为2. 21 士 0. 08，定量发酵3 后细胞进入衰亡期。跟野生菌株相比较，DG150丧失了 96 %以上的产丁醇能力，可以说其已经退化，完全不能用于产溶剂发发酵了。当P2培养基中加入4g/L CaCO3,退化菌株C. beijerinckii DG150生长速度明显加快，细菌浓度也有显著提高，其最终代谢产物总溶剂产量恢复到了野生菌株的50%，总溶剂产率也有了显著性的提高。 图1C. beijerinckii NCIMB8052及退化菌株DG150在整个定量发酵过程中的代谢产物曲线。A，C. beijerinckii NCIMB8052 在 P2 培养基中；B，C. beijerinckii DG150 在 P2 培养基中；C，C. beijerinckii DG150 在 P2+4g/LCaC03 培养基中。图2C. beijerinckii NCIMB8052及退化菌株DG150在整个定量发酵过程中的生长曲线。虚线三角形，C. beijerinckii NCIMB8052 (WT)在P2培养基中；实线圆形， C. beijerinckii DG150 在 P2 培养基中；点线方形，C. beijerinckii DG150 在 P2+4g/LCaC03培养基中。
本发明的效果如下退化菌株模型C. beijerinckii DG150的生长缓慢，最高OD6tltl为2. 21 士 0. 08，定量发酵3 后细胞进入衰亡期。跟野生菌株相比较，DG150丧失了 96 %以上的产丁醇能力，可以说其已经退化，完全不能用于产溶剂发发酵了。当P2培养基中加入4g/L CaCO3，退化菌株C. beijerinckii DG150生长速度明显加快，细菌浓度也有显著提高，其最终代谢产物总溶剂产量恢复到了野生菌株的50%，总溶剂产率也有了显著性的提高(表1)。表1C. beijerinckii NCIMB8052 及退化菌株 DG150 (4g/L CaCO3 添加前后)的代谢参数比较，P2发酵培养基中添加4g/LCaC03，灭菌，无需调节pH。
参数(最大值)C.beijerinckii NCIMB8052 P2培养基C.beijerinckii DG150 P2培养基C.beijerinckii DGl 50 P2 培养基 +4g/LCaC03丙酮(g/L)3.09 ±0.730.12 士 0.011.94±0.69乙醇(g/L)0.94 ±0.240.26 士 0.020.27 士 0.07丁醇(g/L)11.37 ±0.770.55 士 0.035.44 士 1.22总溶剂(g/L)15.40 ± 1.750.86 士 0.027.65 士 0.66乙酸(g/L)2.70 士 0.024.68±0.464.92 士 0.76丁酸(g/L)0.44 士 0.132.8 士 0.244.14±0.37细胞浓度(6OOnm)6.12 ± 0.442.21 士 0.083.40 士 0.23定量发酵时间(h)723648总溶剂产率(g/L/h)0.21 ±0.0240.02±0.00050.16±0.014 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。


本发明公开了一种防止拜氏梭菌菌株退化的方法，以C.beijerinckii NCIMB8052为研究对象，人工获得退化菌株模型，研究退化菌株的代谢，并通过碳酸盐来调节细胞外游离的有机酸的浓度来恢复退化菌株产溶剂的能力。该方法按照如下步骤(1)构建退化菌株模型；(2)恢复退化菌株产丁醇代谢。实验结果显示4g/L、6g/L、8g/L、10g/L CaCO3对DG150恢复产溶剂代谢的程度没有显著性差异，并且其贡献高于2g/L CaCO3的添加。因此4g/L CaCO3为使用量最少，恢复退化菌株产丁醇代谢能力效果最好的使用浓度。