专利名称：一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌及其作为丁酸钠替代品的应用的制作方法目前，随着经济的不断发展和生活水平的不断提高，人们已经越来越认识到“绿色”的基本含义。但是由于经济利益的驱动，抗主素的使用已经开始泛滥，特别是在饲料中大量使用，致使动物体内正常菌群失调以及抑制机体免疫反应的形成，严重的导致二重感染，甚至可引起死亡；其次，抗主素在畜禽体内及其肉、蛋、奶等食品中的残留，经加热处理并不能完全使其灭活，人长期食用这类食品，可能导致慢性中毒等。另外，现代医疗技术、 农药、化肥、激素、同位素和其它化工制品，以及物理因素常会直接或间接对体内的微生态平衡产生不利影响，引起多种疾病。如果在饲料中使用微生态制剂，将大大降低抗生素的用量，解决抗生素解决不了的问题，提高生产效率，向绿色农业的方向前进。微生态学是近年来发展很快的一门生命科学，也是理论与实践结合得相当紧密的一门科学。随着微生态理论的进展，它的实践产物一一微生态制剂不断涌现，并引起临床医学工作者的高度重视。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸菌，它是梭状芽孢菌属中的一个种，是1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的，因此又叫宫入菌。1935年，Kingimiyairi博士从人的粪便和土壤中分离出丁酸梭菌，随后发现其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长。丁酸梭菌作为微生态制剂主要的特点是(1)促进肠道内有益菌群(双歧杆菌、乳酸菌、粪杆菌等)的增殖和发育，抑制肠道内葡萄球菌、念珠菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌等有害菌和腐败菌的生长繁殖，减少胺类、吲哚类物质的产生，而丁酸梭菌本身由于不能分解蛋白质，会减少氨、吲哚、硫化氢等有害物质的产生；( 在肠道内产生维生素B族、维生素K、淀粉酶，有良好的保健作用；(3) 丁酸梭菌的代谢物——丁酸是肠上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质；(4)对多种抗生素有较强的耐受性，与抗生素并用时不会影响其生物作用，并能大幅度降低伪膜性肠炎的发病率；( 丁酸梭菌是厌氧梭状芽孢杆菌，在体内不受胃酸、消化酶、胆汁酸等影响其生物作用，在体外室温下能长期保存；(6) 丁酸梭菌是人体肠道内正常菌群之一，在肠道内阻止有害菌的定植和入侵、纠正肠道内菌群紊乱。目前，国内对于丁酸菌的研究近两年才开始，至今还没有生产厂家。目前市场上的丁酸梭状芽孢杆菌活菌制剂全部从日本进口，价格较高。丁酸钠，又名正丁酸钠盐，产品呈白色至类白色，似绒毛状，可吸湿性粉末，具有特殊的奶酪酸败样气味，易溶于水，水溶液PH呈碱性。因丁酸具有游离性和挥发性的特点，饲料生产中将其制成相对稳定的钠盐——丁酸钠。丁酸钠在我国是允许使用的饲料添加剂品种之一，于2006年被农业部列入《饲料添加剂品种目录》。在动物生产上的应用方式主要是在动物饲料中添加丁酸钠产品(丁壮素、佳宝育、肠益健)，起到肠黏膜营养剂、电解质平衡调节剂、胃肠道微生态调节剂、复合酸化剂、香味剂、诱食剂等作用。目前，国内对丁酸钠在畜牧生产中的应用研究大部分针对幼龄动物。但实际应用发现，丁酸钠产品效果并不稳定， 分析其原因有以下几点(1)饲料原料对丁酸钠有一定的缓冲能力饲料原料的缓冲能力，是影响胃内游离酸量的主要因素。缓冲能力越大，能吸附胃内的游离酸就越多，这使得采食后胃内的游离酸减少，胃内PH值升高，进而影响胃蛋白酶的活性和蛋白质的消化分解。一般来说，蛋白质、钙、磷和矿物质的含量越高，饲料的缓冲能力越高。(2) 丁酸钠用量不好掌握丁酸钠作为有机酸，一方面它的解离度小，酸性较弱， 达到同样的酸化能力添加量比无机酸要大得多，添加成本高。另一方面丁酸钠作为酸化剂， 在饲料日料中的添加是直接性的，添加的酸容易被碱中和，失去酸化作用；或者在胃中吸收过快，又会反射性抑制胃酸分泌，影响胃功能的正常发育；如果无法到达小肠，则不能有效降低小肠中的PH值，无法达到抑制有害微生物生长、促进有益菌生长的目的。此外，饲料日粮的种类、动物的年龄、体重以及饲养环境都会影响丁酸钠的使用量。(3)贮存运输条件受限丁酸钠产品在常规贮存和搬运条件下，处于低温和密封状态下稳定，但不能与性质相反的物质、粉尘、过热物品、强氧化剂混合保存，贮存过程中容易发生稀释结块或造成饲料受潮。(4)技术成本高核素示踪法研究SCFA(短链脂肪酸)吸收的结果表明，机体结肠中SCFA的吸收和代谢能力很强，其中又以丁酸为最快。由于丁酸代谢速度很快，使得机体内丁酸的血清半衰期仅仅只有6分钟。(5)存在不良应激动物口腔黏膜细柔，感受能力强，若用低价、低质的化工级丁酸钠作为诱食剂时，本想起到诱食和保持动物机体健康的作用，但是往往能引起动物黏膜灼伤，导致采食量下降，甚至拒食。此外，丁酸钠可能产生的有害分解产物有一氧化碳、二氧化碳、氧化钠、过敏性和有毒的烟尘与气体，也有可能导致中枢神经系统抑制、眼和皮肤过敏、消化道和呼吸道应激。综上所述，寻求一种有效的丁酸钠的替代品，是畜牧业和饲料业领域急需解决的一大难题。
针对上述现有技术，本发明提供了一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌，并提供了其作为丁酸钠替代品的应用。本发明是通过以下技术方案实现的一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌，该菌株命名为丁酸梭菌(Clostridium bUtyriCUm)Cb-2，已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为 CCTCC M2011384。所述菌株的特征为为专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，其直径为0.6μπι 1. 2 μ mX 3. 0 μ m 7. 0 μ m，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，细菌呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周身鞭毛，能运动。该菌株能产酸产气，能分解蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蜜二糖、淀粉，不能分解松三糖、木糖，不能使明胶液化，还原石蕊，凝固牛乳，凝块碎裂不消化，最佳生长温度为37°C，最佳生长pH值为7. 0。该菌株具有耐酸、耐胆汁、耐高温的性能；同时具有一定的抑菌能力。经试验证明，本发明的丁酸梭菌产酸能力强，尤其是产丁酸能力。经试验证明，本发明的丁酸梭菌对各种原因所致的肠道菌群紊乱、急慢性腹泻、肠易激综合症、非溃疡性消化不良等疾病有显著的效果，且无毒无害。因此，可以以本发明的丁酸梭菌或丁酸梭菌粉剂为原料，用于制备微生态制剂，用于替代丁酸钠进行应用。所述丁酸梭菌粉剂是通过培养上述丁酸梭菌得到的，其培养方式可以为常规培养方式。其最佳的培养生产工艺流程如下(i)菌种选用丁酸梭菌 Clostridium butyricum Cb_2，CCTCC M 2011384 ；(ii)实验室培养将上述丁酸梭菌的冻干粉菌种一环接种于培养基上，无菌操作，封上石蜡凡士林(1 1 ￥/力，；35 421下厌氧培养对 3811;(iii)制备液体种子采用5000mL三角瓶，培养基装量1000mL/5000mL三角瓶， 115°C灭菌20min，冷却后接种，接种量3 % 8 % (ν/ν)，在35 42°C条件下，厌氧培养14 38h，即为液体种子；(iv)种子罐发酵采用50L种子罐，培养基装量为30L ；实消温度115 121°C，时间15 30min ；待培养基温度降为40°C时接种，接种量3% 8% (ν/ν)，罐压0. 05MPa，在 35 42°C条件下，厌氧培养12 38h，转入发酵罐培养；(ν)发酵罐培养采用0. 5Τ发酵罐，培养基装量为350L ；实消温度115 121°C， 时间15 30min ；待培养基温度降为40°C时接种，接种量3% 8% (ν/ν)，罐压0. 05MPa, 厌氧培养16 32h ；(vi)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2 3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；上述步骤(ii) (iii)、(iv)中所述培养基配方为葡萄糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、牛肉浸膏5g/L、碳酸钙10g/L，使用时，调节pH至6. 5 7. 5，115°C条件下灭菌 20min ；步骤(ν)中所述培养基配方为葡萄糖10g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏15g/L、碳酸钙 10g/L、硫酸镁0. 2g/L、磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0. 2g/L，使用时，调节pH至6. 5 7. 5。所述具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌制剂，可以用于制备微生态制剂，具体应用时， 丁酸梭菌制剂可以单独作为有效成分(如饲料添加剂)与玉米淀粉制成微生态制剂，或者 丁酸梭菌制剂与其它至少一种菌制剂以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。所述其它菌制剂为乳酸菌、芽孢菌或/和双歧杆菌等益生菌的常规菌制剂；复配后，各菌制剂之间据有协同作用，能增强产品的功效，促进肠道微生态平衡，提高畜禽免疫力和抗病力，促进其健康快速生长，提高饲料转化率，降低粪便臭味，解决抗生素残留超标等问题。本发明的丁酸梭菌作为新一代饲料添加剂，具有“酸化肠道、修复黏膜、对抗耐药菌、优于丁酸钠”的显著特点，有着广阔的应用前景，必将对整个畜牧业和饲料业产生深远的意义。本发明提供的菌株丁酸梭菌Cb-2 Clostridium butyricum Cb_2，已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO =M 2011384，保藏地址为中国武汉武汉大学。图1为丁酸梭菌平板划线分离示意图。图2为丁酸梭菌革兰氏染色的显微照片(菌体中未染色的部分为芽孢)。图3为丁酸梭菌耐酸性试验结果示意图。图4为丁酸梭菌耐胆汁试验结果示意图。图5为丁酸梭菌Cb-2株pH变化曲线图。图6为健康小鼠与腹泻模型小鼠肠道菌群对比图。图7为治疗后第4天各组肠道内菌群对比图。图8为治疗后第6天各组肠道内菌群对比图。图9为治疗后第8天各组肠道内菌群对比图。
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1. 5产酸能力和抑菌能力测定对新分离的丁酸梭菌Cb-2与试验室保存的一株丁酸梭菌Cb-I分别做产酸能力和抑菌能力测定，步骤为两株菌分别接种于梭菌增殖培养基，在盐水瓶中静置培养，在1 和Mi取样，4000rpm离心lOmin，上清液测定丁酸和乙酸含量；同时16h样品进行抑菌试验，管碟法比较两者抑菌能力。2结果与讨论2. 1菌种的鉴定结果对15个样品处理培养后，以影印平板进行厌氧和好氧培养，得到严格厌氧菌株 10株，选择性培养后镜检得到典型的梭状芽胞菌属菌株1株。对这菌株进一步纯化后得到菌体较大的杆状、次端生椭圆芽孢菌株，初步鉴定为丁酸梭菌，其直径为0.6μπι 1. 2 μ mX 3. O μ m 7. O μ m，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，细菌呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周身鞭毛，能运动。随后进行生理生化试验，发现该菌株能产酸产气，能分解蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、淀粉、蜜二糖，不能分解松三糖、木糖，不能使明胶液化，还原石蕊，凝固牛乳，凝块碎裂不消化(见表1、图1和图2)，由此，判定分离菌株为丁酸梭菌，命名为丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-2,已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011384。表1分离菌株的生理生化特征


本发明公开了一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌，该菌株命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Cb-2，已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011384。经试验证明，本发明的丁酸梭菌产酸能力强，尤其是产丁酸能力。经试验证明，本发明的丁酸梭菌对各种原因所致的肠道菌群紊乱、急慢性腹泻、肠易激综合症、非溃疡性消化不良等疾病有显著的效果，且无毒无害。因此，可以以本发明的丁酸梭菌或丁酸梭菌粉剂为原料，用于制备微生态制剂，用于替代丁酸钠进行应用。具体应用时，丁酸梭菌制剂可以单独作为有效成分与玉米淀粉制成微生态制剂，或者与其它至少一种菌制剂以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。