专利名称：一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用的制作方法全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源化学品的要求，而粮食短缺要求可再生清洁能源化学品的发展要实现不与人争粮、不与作物争地、不与人和作物争淡水。蓝藻(blue-green algae)，又称蓝细菌(cyanobacteria)，是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻广泛分布在淡水、海水甚至是污水中，能够利用CO2和太阳能快速繁殖， 是生物合成能源产品的理想宿主。作为原核生物，蓝藻细胞结构简单、遗传背景与大肠杆菌相似，易于基因操作。近二十年来蓝藻分子生物学的研究进展为对蓝藻进行基因改造进而合成化工产品奠定了基础，已有在蓝藻中合成乙醇的成功案例。太阳能是地球上取之不尽的能源，而(X)2是导致地球变暖的温室气体，全球每年投入数以亿计资金用于CO2减排。因此，通过对蓝藻进行代谢途径改造，使蓝藻将太阳能和CO2直接转化为能源化工产品，是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。乳酸(lactate)又称2_羟基丙酸。因分子中有一个不对称碳原子，而具有旋光性。 因此乳酸有L-乳酸和D-乳酸两种旋光异构体。不同光学性质的乳酸用途不同。乳酸是生产聚乳酸的单体，而聚乳酸的性能与D-乳酸的含量相关，因此D-乳酸是生产优质聚乳酸所必须的。聚乳酸是理想的绿色高分子材料，可完全生物降解，具有良好的机械性能、物理特性、生物相容性及防腐、耐菌性等优点，是其它生物降解材料所无法比拟的。聚乳酸是传统塑料制品的理想替代品，可应用于各行各业，如生产生物可降解塑料及人工合成生物组织等。全球每年对塑料的需求量是200亿公斤，而聚乳酸的产量只有450万公斤，由此可见全球对生产聚乳酸的原料乳酸的需求。由此可见生产光学纯D-乳酸的重要性及必要性。乳酸的生产方法有发酵法、化学合成法和酶转化法。发酵法主要是以粮食为原料， 由乳酸菌对粮食淀粉发酵生产乳酸；化学发和酶法是以能源化学品为原料且污染环境。这些方法主要用于生产L-乳酸或消旋乳酸LD-乳酸，而对光学纯D-乳酸的生产是随着聚乳酸的广泛应用而兴起的。为减缓能源短缺及避免污染环境，近年来科研人员尝试通过代谢工程改造细菌用发酵法生产光学纯乳酸，该方法虽然避免了加剧化石能源短缺的问题，但以粮食为原料，如大量生产将加剧全球粮食短缺问题，无法实现可再生能源的持续发展，因此利用太阳能直接将CO2转化为有机物的光合自养细菌蓝藻是生产光学纯乳酸的理想途径。发明内容本发明的一个目的是提供一种构建重组蓝藻的方法。本发明提供的方法，为将D-乳酸脱氢酶编码基因导入蓝藻的基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻；上述方法为通过代谢工程改造进行。所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中的序列3。在上述方法中，所述D-乳酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1 的自5’末端608-1788位核苷酸或序列表中序列2的自5’末端第605-1785位核苷酸。
在上述方法中，所述重组蓝藻为将双链DNA通过同源重组导入蓝藻的基因组；
其中的双链DNA为含有所述D-乳酸脱氢酶编码基因的DNA ；
而蓝藻具体为淡水蓝藻集胞藻6803或海水蓝藻聚球藻7002 ；
上述方法中的双链DNA具体还包括上游同源臂、下游同源臂和筛选基因；
其中的上游同源臂和下游同源臂具体为如下1)或2)
1)所示的所述上游同源臂和下游同源臂为淡水蓝藻集胞藻6803基因组中乙酰磷酸转移酶基因的上游同源臂和下游同源臂；
2)所示的所述上游同源臂和下游同源臂为海水蓝藻聚球藻7002基因组中乳酸脱氢酶基因的上游同源臂和下游同源臂；
其中的筛选基因具体为卡那霉素抗性基因；
上述的双链DNA具体为如下1)或2)
1)所示的双链DNA依次包括所述乙酰磷酸转移酶基因的上游同源臂、D-乳酸脱氢酶编码基因、筛选基因和所述乙酰磷酸转移酶基因下游同源臂；
2)所示的双链DNA依次包括所述乳酸脱氢酶基因的上游同源臂、D-乳酸脱氢酶编码基因、筛选基因和所述乳酸脱氢酶基因的下游同源臂。
在上述方法中，1)所示的双链DNA的核苷酸序列为序列表中的序列1 ；
2)所示的双链DNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。
在上述1)所示的双链DNA中，淡水蓝藻集胞藻6803基因组中乙酰磷酸转移酶基因的上下游同源臂分别为序列表中序列1的自5’末端第1-601位核苷酸(Upl)和5’末端第2727-3313位核苷酸(Downl)；卡那霉素抗性基因为序列表中序列1的自5’末端第 1795-2726位核苷酸(Km) ；D-Idh为序列表中序列1的自5，末端第608-1788位核苷酸；
在上述幻所示的双链DNA中，海水蓝藻聚球藻7002基因组中乳酸脱氢酶基因的上下游同源臂分别为序列表中序列2的自5’末端第1-598位核苷酸(Up!3)和5’末端第2723-3278位核苷酸(Dowr^)；卡那霉素抗性基因为序列表中序列2的自5’末端第 1792-2723位核苷酸；D-Idh为序列表中序列1的自5’末端第605-1785位核苷酸。
上述的方法具体可以为如下1)或2):
1)所示的方法为将1)所示的双链DNA通过同源重组导入淡水蓝藻集胞藻6803基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻S. Ml ；
2)所示的方法为将1)所示的双链DNA通过同源重组导入海水蓝藻聚球藻7002基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻S. M2。
在上述方法中，
1)所示的方法中，将1)所示的双链DNA通过同源重组导入淡水蓝藻集胞藻6803 基因组中为将重组质粒1导入淡水蓝藻集胞藻6803 ；
其中，该重组质粒1为将1)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒；
2)所示的方法中，将幻所示的双链DNA通过同源重组导入海水蓝藻聚球藻7002 基因组中为将重组质粒2导入海水蓝藻聚球藻7002 ；
其中，该重组质粒2为将2)所示的双链DNA插入pMD_18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒。
由上述方法得到的重组蓝藻也是本发明保护的范围。
本发明的第二个目的是提供一种重组质粒。
本发明提供的重组质粒，为如下重组质粒1或重组质粒2
上述重组质粒1为将上述方法中所述的1)所示的双链DNA插入pMD_18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒；
上述重组质粒2为将上述方法中所述的2)所示的双链DNA插入pMD_18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒。
上述的重组蓝藻或上述的重组质粒在制备D-乳酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的第三个目的是提供一种制备D-乳酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤
先将上述的重组蓝藻进行光照培养，再进行暗培养，收集培养产物，即得到D-乳酸；
上述方法中，所述光照培养和暗培养的培养基均为以无机碳为唯一碳源的培养基；所述培养基具体为BG-Il培养基；
该光照培养的温度具体为_32°C，所述光照培养的光照强度为80μπι/ m2 · s-120ym/m2 · s，所述光照培养为振荡培养，所述振荡频率为100r/min-150r/min，所述光照培养时间为5天-8天；
上述方法中，该暗培养的温度为-32°C，暗培养70小时-74小时；所述暗培养为静置培养。
本发明的实验证明，本发明通过代谢工程改造的方法，构建了重组蓝藻，利用蓝藻可以进行光合自养的特性，即可以利用太阳能将(X)2直接转化为有机物，可以在海水和污水中生长的特性及易于进行基因操作的优点，使重组蓝藻可以利用太阳能和(X)2直接合成光学纯乳酸D-乳酸。本发明通过蓝藻对太阳能和工业废气(X)2的利用，实现大宗化学品乳酸的生产，避免了在能源再生过程中对粮食等有机物的使用，同时又可以利用海水和(X)2有利于环境。因此，利用本发明的重组蓝藻来生产乳酸是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一，也为解决生产光学纯乳酸这一难题提供了新技术。


图1为重组蓝藻S. Ml鉴定图
图2为HPLC检测重组蓝藻S. Ml发酵液中产物
图3为HPLC手性分析重组蓝藻S. Ml发酵液中产物
图4为重组蓝藻S. M2鉴定图
图5为HPLC检测重组蓝藻S. M2发酵液中产物
图6为HPLC手性分析重组蓝藻S. M2发酵液中产物
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大肠杆菌(E. coli)DH5a购自北京全式金生物技术有限公司。
载体pMD-18T 购自北京全式金生物技术有限公司。
淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp. PCC 680 属于色球藻科、集胞藻属；参考文献Zhang S, Spann Kff, et al. Identification of two genes, sll0804and slrl306, as putative components of the C02_concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.J Bacteriol.2008, 190 8234-8237，公众可从中国科学院微生物所获得。
海水蓝藻聚球藻7002 (Synechococcus sp. PCC 700 属于色球藻科、聚球藻属； 参考文献Cantrell A and Bryant DA. Molecular cloning and nucleotide sequence of the psaA and psaB genes of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Plant Mol Biol. 1987，9 :453_468，公众可从中国科学院微生物所获得。
蓝藻表达载体pAM2770 参考文献:ffu X，Li Dff, et al. The Anabaena sp. strain PCC 7120 asrl734 gene encodes a negative regulator of heterocyst. Development. Molecul Microbiol. 2007,64 :782_794，公众可从中国科学院微生物所获得。
BG-Il培养基组成见表1。Trace metal mix A5组成见表2。
表1BG-11培养基组成


本发明公开了一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用。本发明提供的方法，为代谢途径改造并将D-乳酸脱氢酶编码基因导入蓝藻的基因组中，得到产光学纯D-乳酸的重组蓝藻；所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中的序列3。本发明的实验证明，本发明通过代谢工程改造的方法，构建了重组蓝藻，利用蓝藻可以进行光合自养的特性，即可以利用太阳能将CO2直接转化为有机物，可以在海水和污水中生长的特性及易于进行基因操作的优点，使重组蓝藻可以利用太阳能和CO2直接合成光学纯乳酸D-乳酸。