一种生产l-乳酸的方法及其专用热噬淀粉芽孢杆菌的制作方法[0002]乳酸(Lactic Acid)又名二羟基丙酸，是世界三大有机酸之一。作为一种传统的多用途精细化学品，乳酸可作为酸味剂、芳香剂、防腐剂、植物生长调节剂、生物可降解性材料、药物和农药等，应用于食品、制药、酿造、制革、纺织、环保和农业中。乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和发酵法三种。由于合成法所用的原料是乙醛和剧毒物氢氰酸，因此合成乳酸应用于食品不能被广泛接受，此外其生产成本也较高。酶法催化可以专一性地得到光学纯乳酸，但其反应过程研究难度很大，尚未应用于工业化生产。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条件的选择而获得D-乳酸、L-乳酸或是两者一定比例的混合物，能以淀粉、纤维素等可再生资源分解所得到的葡萄糖等为原料发酵生产乳酸，且生产成本低、产品安全性高，是大规模生产乳酸的主要方法。[0003]L-乳酸的生产成本是制约聚乳酸规模化应用的关键因素之一。提高发酵法生产L-乳酸过程中发酵液中L-乳酸的浓度有利于降低成本。纤维生物质原料具有非粮资源的优势，有利于降低乳酸生产的原料成本，是控制L-乳酸生产成本的有效途径。因此，获得能够直接利用纤维素或纤维糖类发酵生产高光学纯L-乳酸的菌株具有重要的实际工业应用价值。
[0004]本发明的目的是提供一株热噬淀粉芽孢杆菌及其在生产L-乳酸中的应用。[0005]本发明所提供的热曬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)具体为热曬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3,是从山东莱芜某污水处理厂的活性污泥中筛选得到的。该热曬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3已于2012年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC N0.6153。[0006]热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillusthermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153 菌体细胞呈细长杆状，排列不整齐。革兰氏染色呈阳性。在固体培养基表面，菌体形成半透明的乳白色菌落，菌落光滑，边缘整齐。无鞭毛、无芽孢、生长温度30-65°C、接触酶阳性，其16s rDNA序列如序列表中序列I所示。[0007]本发明的再一个目的是提供一种菌剂。[0008]本发明所提供的菌剂的活性成分为所述热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillusthermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种生产L-乳酸的方法。
[0010]本发明所提供的生产L-乳酸的方法是发酵所述热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillusthermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153,或以其为活性成分的所述菌剂,得到L-乳酸。[0011]在所述方法中，所述热曬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)CB3CGMCCN0.6153的发酵培养基中含有碳源、氮源和用于控制发酵液pH的中和剂；所述发酵培养基中的碳源可为纤维二糖、葡萄糖和果糖中的至少一种；所述碳源在所述发酵培养基中的终浓度可为20-100克/升(如20-50克/升)。
[0012]在本发明中，所述发酵培养基中的碳源可为纤维二糖，所述纤维二糖在所述发酵培养基中的终浓度具体可为20-50克/升(如20克/升);所述发酵培养基中的碳源也可为葡萄糖，所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度具体可为20-100克/升(如20-50克/升、20克/升或50克/升)。
[0013]在所述方法中，所述发酵培养基中的所述氮源为酵母提取物(安琪酵母股份有限公司)，所述中和剂为碳酸钙；所述酵母提取物在所述发酵培养基中的终浓度可为3-10克/升(如5克/升)，所述碳酸钙在所述发酵培养基中的终浓度可为10-40克/升(如12-30克/升、12克/升或30克/升)。
[0014]在所述方法中，所述发酵培养基的pH可为5.5-7,具体如6.5。
[0015]在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基的组成如下:纤维二糖或葡萄糖20-50克/升，酵母提取物5克/升，碳酸钙12-30克/升，pH值为6.5。
[0016]在所述方法中，所述发酵的条件可为30_65°C培养36-72小时。在本发明中具体为45-550C (如50°C)培养48-72小时(如48小时或72小时)。
[0017]在所述方法中，所述发酵的培养方式为每12小时搅拌1-2次，每次搅拌的时间为30-45分钟，搅拌转速为30-50 转/分钟，旋转半径为30-40mm。根据实际情况，也可以选择静置培养。在本发明的一个实施例中，所述发酵的培养方式具体为每12小时搅拌I次，每次搅拌的时间为30分钟，搅拌转速为30转/分钟，旋转半径为30-40mm。
[0018]在所述方法中，还可将所述热曬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)CB3CGMCC N0.6153先接入如下种子培养基中，在45_55°C培养24-48小时(如在50°C培养48小时)，再接入所述发酵培养基；所述种子培养基每升中含有:葡萄糖20克，酵母粉5克，碳酸钙12克，余量为水；所述种子培养基的pH为6.5。
[0019]本发明的又一个目的是提供所述菌剂的制备方法。
[0020]该方法可包括如下步骤:将所述热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillusthermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153作为活性成分，得到所述菌剂。
[0021]本发明利用热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3CGMCCN0.6153生产L-乳酸，以20克/升纤维二糖为底物，在45°C _55°C条件下直接发酵生产L-乳酸，L-乳酸浓度为12.2克/升，光学纯度大于98%。本发明所提供的热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153可直接利用纤维二糖发酵生产高光学纯L-乳酸，有利于降低原料成本，具有重要的实际工业应用价值。
[0022]保藏说明
[0023]菌种名称:热噬淀粉芽孢杆菌
[0024]拉丁名:(Bacillusthermoamylovorans)
[0025]菌株编号:CB3
[0026]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0027]保藏机构简称:CGMCC[0028]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0029]保藏日期:2012年5月25日
[0030]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.6153



[0031]图1 为热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153 利用纤维二糖直接发酵生产L-乳酸过程中，在不同发酵温度下的L-乳酸产量。

[0032]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]下述实施例中所涉及的各个参数的测定方法如下:
[0035]L-乳酸含量的测定:采用Agilentl260液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定，有机酸柱(美国Bio-Rad公司，Aminex HPX-87H，ff(5ym)4.6IDX250_，有机酸分离用)，流动相为0.005mol/L硫酸，流速0.6ml/min,进样量5 μ L，紫外检测器，检测波长210nm，操作温度65°C。L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。
[0036]L-乳酸光学纯度的测定:采用Agilentl260液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10ff,4.6mm IDX50mm，光学异构体分离用)。具体操作条件为:2mM的硫酸铜作为流动相，流速0.5ml/min,进样量10 μ 1，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25°C。利用L-乳酸和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。光学纯度(optical purity)是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess)表示。本发明中L-乳酸的光学纯度按以下公式计算:(L-乳酸含量-D-乳酸含量)+ (L-乳酸含量+D-乳酸含量)X 100%。
[0037]糖酸转化率均定义为:L_乳酸产量(克/升)+纤维二糖的初始量(克/升)X100%。
[0038]下述实施例中所用到的酵母提取物均购自安琪酵母股份有限公司。
[0039]实施例1、热曬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3的分离筛选和鉴定
[0040]本实施例中所用到的培养基组成如下:
[0041]固体斜面培养基:纤维二糖20克/升，酵母提取物5克/升，碳酸钙12克/升，琼脂粉15克/升，pH值为6.5。115°C条件下灭菌20分钟。
[0042]液体培养基:纤维二糖20克/升，酵母提取物5克/升，碳酸钙12克/升，pH值为6.5。115°C条件下灭菌20分钟。
[0043]一、热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3的分离筛选
[0044]从中国山东莱芜某污水处理厂取得活性污泥样品，称取5克泥样于250ml三角瓶中，加入100ml生理盐水，充分混均后用无菌水稀释10000倍涂布于含有纤维二糖的固体斜面培养基上，50°C培养，待长出单菌落后，部分单菌落由于产酸将菌落周围培养基中的碳酸钙溶解而形成透明圈。挑取透明圈较大的单菌落，接种于IOml含有纤维二糖的液体培养基中，50°C静置培养72小时，测定发酵液中L-乳酸浓度，挑取一株L-乳酸产量最高的菌株，接种于含有纤维二糖的固体斜面培养基上冷藏备用。将该菌株命名为CB3。
[0045]二、热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3 的鉴定
[0046]从形态、生理生化特征和16s rDNA序列同源性几个方面对步骤一获得的菌株CB3进行鉴定。其中，形态特征观察和生理生化特性鉴定参见“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京:科学出版社，2001.2)中描述的方法。
[0047]1、形态学鉴定
[0048]经形态学鉴定，结果表明步骤一分离筛选得到的菌株CB3为革兰氏阳性菌，细胞长杆状，长2.5-3.5 μ m，宽0.7-0.8 μ m,排列不整齐。在固体培养基表面，菌体形成半透明的乳白色菌落，菌落光滑，边缘整齐。无鞭毛、无芽孢。
[0049]2、生理生化特征鉴定
[0050]经生理生化特征鉴定，结果表明步骤一分离筛选得到的菌株CB3可利用海藻糖、山梨糖醇、葡萄糖、乳糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、松三糖、鼠李糖、半乳糖、七叶苷、甘露糖；但不能利用蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、肌醇、棉子糖。氧化酶阴性。溶血试验阴性。能够在30°C-65°C生长。
[0051]3、16s rDNA序列同源性分析
[0052]TE缓冲液:10mmol/L的三轻甲基氨基甲烧(Tris)、lmmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0。
[0053]CTAB/NaCl溶液:质量体积比为10%的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于
0.7mol/L 的 NaCl 中。
[0054]10倍浓度的PCR反应缓冲液:500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、lmg/ml的牛血清白蛋白、4 μ 125mmol/LMgCl2,1 μ 14 种 dNTP 的混合物。
[0055]16s rDNA序列同源性分析的具体操作如下:
[0056]培养5ml的步骤一获得的菌株CB3的培养物至饱和状态，取1.5ml培养物，6000转/每分钟离心2分钟；沉淀物加入565 μ I的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬，加入30 μ I质量体积比为10%的十二烷基磺酸钠(SDS)和5 μ I浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37°C温育I小时；加入100 μ I浓度为5mol/L的NaCl，充分混匀，再加入80 μ I的CTAB/NaCl溶液，混匀，于65°C温育10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿和异戊醇的体积比=24:1 )，混匀，12000转/每分钟离心5分钟，将上清液转入一个新管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比=25:24:1)，混匀，12000转/每分钟离心5分钟，将上清转入一支新管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，用一个封口的离心管将沉淀转移至Iml的70%乙醇中洗涤；12000转/每分钟离心5分钟，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于50 μ I的TE缓冲液，得到步骤一获得的菌株CB3的基因组DNA作为模板。
[0057]以提取的基因组DNA为模板，利用购自上海生工生物工程有限公司的真细菌引物27f和 1492r，进行 PCR 扩增。所述的 27f 引物序列为:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；所述1492r引物序列为:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。在50 μ I反应体系依次混匀下列试剂:35μ1 Η20，5μ 110倍浓度的PCR反应缓冲液，0.5μ I的27f引物，0.5 μ I的1492r引物，0.5 μ I模板DNA即步骤一获得的菌株CB3的基因组DNA，0.5 μ I Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。将混合物在94°C加热5分钟。94°C变性I分钟，50°C退火I分钟，72°C延伸2分钟，总共30个循环。最后一个循环后，于72°C下保温10分钟，使反应混合物扩增充分，得到菌株CB3的16S rRNA基因的PCR扩增产物，将产物测序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)在线完成。
[0058]测序结果表明，步骤一获得的菌株CB3的16S rRNA基因序列长度为1501bp，如序列表中序列I所示。
[0059]鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离筛选得到的菌株CB3鉴定为热曬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)?该热曬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)CB3已于2012年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC N0.6153。[0060]实施例2、热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153利用各种碳源发酵生产L-乳酸(三角瓶)
[0061]本实施例中所用的培养基的组成如下:
[0062]固体斜面培养基:葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，碳酸钙12克/升，琼脂粉15克/升，pH值为6.5。115°C条件下灭菌20分钟。
[0063]液体培养基:碳源20克/升，酵母提取物5克/升，碳酸钙12克/升。该培养基的初始PH为6.5。115°C条件下灭菌20分钟。其中碳源分别为:葡萄糖、纤维二糖、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖，加量均为20克/升。
[0064]本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤:
[0065](I)斜面培养:热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3CGMCCN0.6153菌种接种于固体斜面培养基上，50°C培养36小时；
[0066](2)种子培养:将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml液体培养基的100ml三角瓶中，50°C静置培养48小时，制得种子培养液；
[0067](3)发酵培养:在装有30ml液体培养基的100ml三角瓶中接入3ml步骤(2)的种子养液，放置于50°C静置培养48小时,结束发酵。
[0068]发酵结束时，取发酵液，10，000转/分钟离心5分钟，取上清液，根据上述方法检测发酵液中生成的L-乳酸的浓度。
[0069]结果显示，50°C培养温度下，利用葡萄糖为碳源，产L-乳酸为17克/升；利用果糖为碳源，产L-乳酸为17克/升；利用纤维二糖为碳源，产L-乳酸为12克/升；利用半乳糖为碳源，产L-乳酸为0.9克/升；利用其它糖类为碳源不产L-乳酸。以上结果显示热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153的最佳碳源为六碳糖-葡萄糖和果糖，其次是纤维二糖。
[0070]实施例3、热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153利用葡萄糖为碳源发酵生产L-乳酸的最佳反应温度的测定(三角瓶)
[0071]本实施例中所用的培养基的组成如下:
[0072]固体斜面培养基:葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，碳酸钙12克/升，琼脂粉15克/升，pH值为6.5。115°C条件下灭菌20分钟。
[0073]液体培养基:葡萄糖50克/升，酵母提取物5克/升，碳酸钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。115 °C条件下灭菌20分钟。
[0074]本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤:
[0075](I)斜面培养:热卩遼淀粉芽抱杆菌(Bacillus thermoamylovorans) CB3CGMCCN0.6153菌种接种于固体斜面培养基上，50°C培养36小时；
[0076](2)种子培养:将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml液体培养基的100ml三角瓶中，50°C静置培养48小时，制得种子培养液；
[0077](3)发酵培养:在装有30ml液体培养基的100ml三角瓶中接入3ml步骤(2)的种子养液，分别放置于37°C、42°C、50°C、55°C、60V和65°C静置培养48小时，结束发酵。
[0078]发酵结束时，取发酵液，10, 000转/分钟离心5分钟，取上清液，根据上述方法检测发酵液中生成的L-乳酸的浓度。实验重复三次，结果取平均值。
[0079]结果如表1，37°C培养温度下，L-乳酸产量为20.8克/升；42°C培养温度下，L-乳酸产量为26.2为克/升；50°C培养温度下，L-乳酸产量为29.7克/升；55°C培养温度下，L-乳酸产量为18.9克/升；60°C培养温度下，L-乳酸产量为12.6克/升；65°C培养温度下，L-乳酸产量为0.7克/升。以上结果显示热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillusthermoamylovorans) CB3CGMCC N0.6153利用葡萄糖的最佳发酵温度为50°C。
[0080]表1利用葡萄糖作 为碳源在不同温度下发酵L-乳酸3次重复实验结果
[0081]