专利名称：制备隐形眼镜状的羊膜敷料的方法羊膜是厚度为0. 02至0. 5mm的位于胎盘内表面中的膜，其具有上皮细胞、基底膜、 致密层、成纤维细胞层和海绵层的堆叠式结构。羊膜是无血管的并且不表达组织相容性的 抗原，因此在其移植后不发生免疫排斥(Akle CA等，Lancet, 2 :1003-5(1981) ；Dua HS等， Br. J. Ophthalmol. ,83 :748-52 (1999))。由于羊膜的基底膜由IV型胶原蛋白、层粘连蛋白 和α6/β4整合蛋白组成，并且其间隙组织由I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、透明质酸、纤 连蛋白和α 5/β 1整合蛋白组成，因此羊膜可有助于细胞的分裂和迁移。在眼科学中，De Rotth在1940年首次报道了使用羊膜治疗结膜组织损伤(De Rotth Α.，Arch. Ophthalmol. ,23 :525-5 (1940))。在 1993 年，Batle 禾口 Perdomo 再次提 出 了使用羊膜作为结膜替代物(Batle JF, Perdomo FJ, Ophthalmol. , 100 :107(1993))。 Kim和Tseng后来在1995年指出，在上皮细胞去除和角膜缘片层切除术(limbal lamella keratectomy)后，羊膜有助于兔子的角膜表面重建(Kim JC和Tseng SC, Cornea, 14 473-84(1995))。已经报道了羊膜有助于角膜和结膜的上皮的再形成并抑制炎症，因此其移植在治 疗伴有炎症的疾病中有效，例如临床试验中的顽固性角膜上皮缺损和溃疡。羊膜作为基底 膜，其负责维持角膜和结膜细胞生长以及保持其特性，因此，它有助于上皮细胞的迁移，加 强基底上皮细胞的附着力，促进上皮分化和防止上皮细胞凋亡以促进在伤口愈合处的上皮 再生。进一步地，通过粘附在炎性细胞上防止其渗透，羊膜具有抗炎活性。基于羊膜的这种 特性，其已用于治疗各种眼表疾病，诸如角膜溃疡、翼状胬肉、睑球粘连和化学灼伤。而且， 据报道羊膜包含参与伤口愈合的各种生长因子，例如EGF、TGF-a、KGF、HGF、bFGF、TGF-β 1 和TGF-β 2，而且在从羊膜上清除上皮细胞层后这些生长因子保持完整(Noriko Koizumi 等，Current Eye Research，卷20，第3期，173-177 (2000))。尽管羊膜作为生物移植材料 通过普通方法制备，该方法去除了可能引起炎症和免疫反应的同源细胞和异源细胞，然而 由于完整生长因子的存在，它在伤口愈合中的有效性得以保持。因此，羊膜是有效和安全的 生物移植材料。为了治疗角膜上皮缺损，需要为上皮细胞连续供氧，从而保持角膜上皮细胞含有 充足的水分，以及去除引起上皮细胞摩擦的特异性因子。如果满足这种条件且基底膜没有 缺损，则上皮细胞可以增殖。但是，除了使用羊膜方法外的常规方法不能满足所述条件。由 于羊膜本身具有充足的高含水量，其移植不影响角膜表面的水分并且能防止眼睛遭受眨眼 引起的机械摩擦损伤。进一步地，羊膜显示出比由合成聚合物材料制作的治疗镜更高的氧 渗透性，这有益于角膜上皮细胞的重建。为了将羊膜应用于治疗眼表疾病，必需进行需要高度精细的外科技术和较长手术时间的10-0尼龙缝合，这经常产生副作用，诸如缝线脓肿、形成肉芽肿瘤和组织坏死以及 当去除缝合时患者的不适。为了解决所述问题，美国专利号7，494，802中公开了一种将羊膜固定至支撑物上 的方法，而且由其得到的产品商品化为I^rokera^^BioTissue，USA)。用来在眼科手术后使 用的ftOkera 由硬质聚碳酸酯制备而且通过使用0型环将羊膜固定在其上部具有15_16mm 孔的主体上而制备。但是，使用I^rokera 可引起下述问题i)羊膜不覆盖角膜突出的外周 围区域；ii)羊膜可能通由于眨眼而移位；iii)在上皮细胞长出之前羊膜的一部分可能由 于眨眼被损坏；和iv)硬质材料刺激眼睛。为了解决这些与支撑物使用有关的问题，本发明人开发出一种制备隐形眼镜状的 羊膜敷料的方法，其不使用任何支撑物而将羊膜固定于眼睛上。
因此，本发明的目的是提供一种制备隐形眼镜状的羊膜敷料的方法。本发明的另一个目的是提供一种由本发明的方法制备的隐形眼镜状的羊膜敷料。一方面，本发明提供了一种用于制备隐形眼镜状的羊膜敷料的方法，其包括(a)将羊膜与包含圆柱形部分和位于圆柱形部分上部的凸出部分的模的凸出部分 接触，使得羊膜的外周围绕圆柱形部分垂下(drape)；(b)将环放置在覆盖凸出部分的羊膜上并将环固定至圆柱形部分的侧面上；(c)交联羊膜；和(d)沿着模的凸出部分和圆柱形部分之间的边界切割羊膜，以获得隐形眼镜状的 羊膜敷料。另一方面，本发明还提供了一种通过本发明的方法制备的隐形眼镜状的羊膜敷 料。通过本发明的方法制备的隐形眼镜状的羊膜敷料能够解决与缝合羊膜有关的问 题，例如高度精细的外科缝合技术，较长的手术时间、缝线脓肿、肉芽肿瘤形成、组织坏死和 患者不适；以及与支撑物的使用有关的问题，例如，由于眨眼去除了支撑物，支撑物遭到破 坏，以及造成不适，并因此对治疗眼表疾病是有用的。当将下述描述与附图结合时，本发明的上述和其它目的和特征将变得显而易见， 附图分别示出了图1 根据本发明用于制备隐形眼镜状的羊膜敷料的模的横截面示意图；图2 根据本发明用于制备隐形眼镜状的羊膜敷料的0型环的透视图；图3 羊膜和模的复合体的顶透视图；图4 使用车床用以获得本发明的隐形眼镜状的羊膜敷料的旋转和切割操作；图5 通过根据本发明的方法制备的隐形眼镜状的羊膜敷料的两幅照片；图6 在敷料中心具有用于获取影像的孔的隐形眼镜状的羊膜敷料的顶透视图；图7 在敷料中心具有用于获取影像的孔的隐形眼镜状的羊膜敷料的两幅照片；图8 各种隐形眼镜状的羊膜敷料的顶透视图，其每一个为获得影像在敷料中心具有多个孔；图9 本发明的隐形眼镜状的羊膜敷料的照片，其每一个在敷料中心具有用于获 取影像的各种形状的孔；图10 水合具有交联或不具有交联的羊膜敷料的结果；图11 使用六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)将由牛的羊膜制备的各种羊膜敷料移植 到动物中的结果；图12 分别用人羊膜、无细胞牛羊膜和治疗镜作为对照治疗角膜上皮引起烧伤的 兔子后，评价角膜混浊程度；图13 分别用人羊膜、无细胞牛羊膜和治疗镜作为对照治疗角膜上皮引起烧伤的 兔子后在实质层角膜中的炎性细胞的照片；具体实施例下面将详细描述本发明。除非另有规定，本文使用的技术和科学术语具有如本发明所属技术领域的普通技 术人员通常所理解的相同含义。而且，本文提及的所有文件以参阅的方式全文并入于此。本文所使用的术语“羊膜敷料”是指由羊膜制成的医疗器材，并且特别表示为治疗 眼表疾病而与角膜接触的医疗器材。同样，本文所使用的术语“隐形眼镜状的羊膜敷料”是 指具有与隐形眼镜类似的硬度而且可以以与标准隐形眼镜完全相同的方式与角膜接触而 使用，而不使用缝合或粘附材料的敷料。该术语可以与术语“羊膜隐形眼镜”互换使用。本发明提供了一种制备隐形眼镜状的羊膜敷料的方法，其包括(a)将羊膜与模 的凸出部分接触，模包括圆柱形部分和位于圆柱形部分上部的凸出部分，使得膜的外周围 绕圆柱形部分垂下；(b)将环放置在覆盖凸出部分的羊膜上并将环固定至圆柱形部分的侧 面上；(c)交联羊膜；和(d)沿着模的凸出部分和圆柱形部分之间的边界切割羊膜，以获得 隐形眼镜状的羊膜敷料。本发明方法的步骤(a)包括将羊膜与模的凸出部分接触，模包括圆柱形部分和位 于圆柱形部分上部的凸出部分，使得羊膜的外周围绕圆柱形部分垂下。模包括圆柱形部分和凸出部分，并且为了成形为隐形眼镜状优选地具有适当的直 径和基弧。具体而言，圆柱形部分优选地具有8至22mm的直径并且凸出部分优选地具有 6. 0至10. Omm的基弧。模还可以包括支撑用于接触和紧固羊膜的固定在圆柱形部分下部上 的环的支撑部分，或者与支撑部底表面的中间连接的手柄部分。作为本发明的示例，可使用 图1所例示的模。制作模的材料可以从由丙烯酸树脂、缩醛树脂、聚四氟乙烯(Teflon)、不 锈钢和钛组成的组中选择，但是其不局限本发明的范围。羊膜可以来源于哺乳动物，优选来源于人或者牛。羊膜可以预先清洗或预处理以 去除其细胞。羊膜可以用本领域已知的方法清洗(参见Kim JC和Tseng SC, Cornea, 14 473-84(1995))，并且用本领域已知的合适溶液预处理以去除可以引起发炎和免疫反应的 其细胞。在步骤(a)中使用的羊膜在低温条件下储存备用。使用的羊膜数量可以根据羊膜的厚度、强度和透明度而改变。通常，使用一层羊 膜。但是可将至少两层重叠的羊膜放置在模的凸出部分上以获得期望的羊膜敷料强度。同 样，为了解决由羊膜自身的不透明引起的获取影像(vision)的困难，所述方法还可包括在步骤(a)之后，在羊膜的中间形成具有直径1至7mm的圆孔或者形成至少两个孔，优选地为 多个孔，每一个具有100至1，000 μ m的直径。为了减轻由孔导致的不平坦表面所产生的疼 痛或异物感，至少还可在现有的膜上放置一个羊膜以形成多层羊膜。本方法的步骤(b)包括将环放置在覆盖凸出部分的羊膜上并将环固定至圆柱形 部分的侧面上。环(或“0型环”)用于将羊膜与模接触并将羊膜固定在模上，并且为了与模的圆 柱形部分配合优选制成具有适合的直径。制作环的材料可以从由丙烯酸树脂、缩醛树脂、聚 四氟乙烯(Teflon)、聚氨酯、橡胶、硅橡胶和全氟弹性体组成的组中选择，但是，其不限制本 发明的范围。可以用本领域已知的各种干燥过程干燥固定在模上的羊膜，例如，自然干燥， 冷冻干燥和真空干燥。本发明方法的步骤(C)包括交联羊膜。当将步骤(b)中所获得的干燥的羊膜进行水合时，其无法保持隐形眼镜状并恢复 到原始的无形状的软膜。因此，为了防止这种情况，羊膜应经过交联过程。可以通过物理或 化学交联处理进行交联。物理交联处理包括UV照射和脱氢热(dehydrothermal)处理。UV 照射处理优选通过用波长为2M至305nm的UV照射羊膜10至240分钟而进行并且脱氢热 处理可以通过将羊膜在温度为90至105°C置于最多IOOmTorr的真空条件下60分钟至72 小时而进行。化学交联处理可通过将羊膜浸入从由碳化二亚胺、1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙 基)碳化二亚胺(EDC或EDAC)、戊二醛、甲醛、六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)、葡萄聚糖和葡 萄糖组成的组中选择的溶液中而进行。本方法的步骤(d)包括沿着模的凸出部分和圆柱形部分之间的边界切割羊膜，以 获得隐形眼镜状的羊膜敷料。为了获得隐形眼镜状的羊膜敷料，使用车床和激光器沿着模的凸出部分和圆柱形 部分之间的边界旋转并切割羊膜(图4)。进一步地，在步骤(d)之后，可将上述步骤所获得的羊膜敷料用Y-射线照射或电 子束辐照消毒。同样，本发明提供了由根据本发明的方法制备的用于治疗眼表疾病的隐形眼镜状 的羊膜敷料。下面的实施例用于说明本发明而非限制其范围。实施例1 羊膜的制备(1-1)人羊膜的制备将人羊膜通过Kim和Tseng的论文所公开的方法(Kim JC和Tseng SC, Cornea, 14:473-84(1995))进行处理。从实施剖腹产术的孕妇的胎盘上分离羊膜。孕妇已预先进 行了 B型和C型病毒性肝炎、HIV和梅毒筛选，而且只使用那些母血血清学结果呈阴性的胎 盘。将因此得到的羊膜依次用灭菌盐水溶液和次氯酸钠清洗几次，并用纯净水反复清洗。所 得到的膜在低温条件下O 8°C )储存备用。(1-2)牛羊膜的制备将牛羊膜通过下面的步骤处理。分娩后得到牛的胎盘，并且从其中分离出羊膜并 用盐溶液清洗几次以去除碎片和血迹。得到的羊膜用灭菌盐水溶液和次氯酸钠清洗。使 用刮刀去除羊膜的基质层并用消毒盐水溶液和纯净水反复清洗。得到的膜在低温条件下0 8°C)储存直至使用。(1-3)处理羊膜以去除炎性和免疫物质为了防止炎性和免疫反应，通过下面的步骤处理(1-1)和(1-2)中得到的每一个 羊膜。将人或牛的羊膜在低温条件下储存于消毒盐水溶液中。将500cm2的分离的羊膜浸 入IL的95%乙醇中并冷藏过夜以去除其中的脂质成分。将羊膜浸泡在IL的纯净水中并在 10分钟内清洗三次。然后使用刮刀去除羊膜的基质层。得到的羊膜在低温条件下被储存在 IL的70%乙醇中一整天，以使病毒失去活性并浸入IL含有0. 2% EDTA和0. 9%氯化钠的 乙二胺四乙酸(EDTA)/氯化钠溶液(pHll)中。将得到的混合物以150rpm搅拌1小时以除 去可溶的碱性杂质。其后，将得到的羊膜浸入含有0. 05%胰蛋白酶、0. 02% EDTA和0. 9% 氯化钠的胰蛋白酶/EDTA/氯化钠溶液(pH 7.4)中并且将得到的混合物在37°C进行酶反应 1小时。将因此得到的羊膜浸泡在IL的70%乙醇中并将得到的混合物以150rpm搅拌1小 时以去除残余脂质。得到的羊膜依次用碱溶液(PH 11)浸泡，以150rpm搅拌1小时，用含 有0. 2% EDTA的酸溶液(pH 2)浸泡并以150rpm搅拌1小时，以使羊膜处于肿胀状态，然后 用IL份的纯净水以150rpm在30分钟内清洗三次。得到的膜在低温条件下O 8°C )储 存备用。实施例2 模和环的制备如图1和2所示所制造的用于形成隐形眼镜状的羊膜的模和用于将羊膜与模接触 的环(或“0型环”)。模由具有14mm直径的圆柱形部分、具有8. 4至8. 8mm基弧的凸出部 分、支撑部分和手柄部分组成。支撑部分包括支撑用于接触和紧固羊膜的环的支撑物，并且 手柄部分具有连接至支撑部分底表面中间的圆柱形状。模由缩醛树脂制成。制造图2的0 型环，以适合具有特定基弧的各个模。0型环由Tefl0n(14. Imm内部直径)或全氟弹性体 (12mm内部直径)制成。实施例3 羊膜的准备为了使(1-1)至(1-3)中获得的羊膜具有隐形眼镜状，使羊膜与实施例2中获得 的隐形眼镜状的模接触，然后用0型环固定在模上。具体地，将羊膜切割至模的尺寸，然后使其上皮细胞层面朝下地与模的凸出部分 接触(图1)。在羊膜重叠的情况下，重叠最后一层羊膜使得其上皮细胞层朝外。随后将0 型环(图幻放置在羊膜或重叠的羊膜上以完全覆盖模，然后在超净台中自然干燥、冷冻干 燥或真空干燥。干燥羊膜的顶透视图(包括模)如图3所示。实施例4 羊膜隐形眼镜状的固定(4-1)使用物理交联处理固定形状如果将实施例3中获得的干燥羊膜进行水合，则其不能保持隐形眼镜状并恢复到 最初的平柔软的平面薄膜。为了防止这种情况，将模、0型环和实施例3中获得的羊膜的 复合体经过物理交联步骤。具体地，在95°C、100°C或105°C的温度下，将复合体置入最多 IOOmTorr的真空中48至72小时。(4-2)使用化学交联处理固定形状为了达到比通过实施例G-1)的物理交联处理所实现的更有效的交联，通过使用 HMDI作为交联剂进行化学交联处理。特别地，将实施例3中获得的复合体浸入含有0. 2% HMDI的甲醇溶液中30分钟至12小时，用甲醇洗掉残余的HMDI，并在超净台中干燥。作为该溶液的替代，可以分别使用含有0. 1 3% HMDI的0. 9%的盐水溶液、乙醇(10 100% ) 或甲醇(10 100% )，或含有0. 1 5% Tween 80或iTritonX-IOO的0.9%的盐水溶液。实施例5 羊膜的切割、清洗和消毒为了从实施例4中获得的模、0型环和羊膜的复合体中分离出隐形眼镜状的羊膜， 将复合体与车床的转子结合，从而以高速旋转并用精度为1/100 l/1000mm的金刚石切削 刃进行切割，如图4所示。所得到的隐形眼镜状的羊膜用Tween 80溶液或Triton X-100 溶液(0. 1 5%)清洗，用盐水溶液反复清洗，并用已过滤三次的纯净水清洗以完全去除残 余的交联剂。随后，为了作为敷料使用，将羊膜干燥、密封、包装并用Y-射线以10 25kGy 照射或电子束辐照消毒。因此获得了如图5所示的隐形眼镜状的羊膜敷料。例6 用于获得影像的孔的形成尽管羊膜本身是透明的，然而由于其不透明难于看穿羊膜的重叠层。因此，将实施 例3中获得的羊膜用车床或CO2激光器打孔(GC111 ；EO Technics, South Korea)使其中间 形成具有1至7mm直径的孔(图6和图7)。进一步地，不是形成一个孔，而是在羊膜的中间 形成具有大约100至1，000 μ m直径的多个孔以获得影像(图8和图9)。也可以用绿光激光器和UV激光器替代(X)2激光器。同时，打孔的羊膜敷料在打孔部分可能具有不平坦的表面，因此羊膜敷料的使用 可能在眨眼时刺激眼睑的内表面使眼睛产生疼痛或异物感。因此，在打孔后可以在其上重 叠另一个羊膜以减轻刺激。实验例1 羊膜敷料的交联效果为了研究实施例4中交联处理后的形状固定效果，将实施例3中获得的羊膜在化 学交联处理后切割(试验组)和未经化学交联处理切割(对照组)，分别进行下面的步骤。 将试验组和和对照组在室温下浸入盐水溶液中30分钟，然后观察其形状。如图10所示，证 实了对照组经过水合作用失去其隐形眼镜形状，而试验组尽管经过水合作用仍保持了其隐 形眼镜状。因此，发现羊膜敷料的隐形眼镜状可以通过交联作用有效地保留。实验例2 羊膜中生长因子的定量测定为了确定羊膜中生长因子的存在和其数量，通过酶联免疫吸附法对在人和牛之间 具有交联反应的各种生长因子中的bFGF和KGF进行定量分析(ELISA ；R&D system, USA)。 实施例(1-1)和(1-2)中获得的人羊膜、牛羊膜和无细胞牛羊膜用作实验样品。样品经过冷 冻干燥并在冷冻研磨机(Spex，USA)中研磨成粉末。将60mg的各个粉末样品加入到含有2mL 磷酸盐缓冲盐水(PBS ；pH7. 4)的试管中并且在低温条件下通过高速搅拌器以10，OOOrpm以 1分钟为间隔提取生长因子五次。在4°C，以13，OOOrpm离心分离20分钟后，收集上层清液， 通过酶联免疫试剂盒(ELISA kit)测定生长因子的量。基于通过蛋白质定量测定(bradford assay)所测定的总蛋白质量，计算提取的每一种生长因子的量。所测定的生长因子的含量 如下面的表1所示。表
本发明涉及一种制备隐形眼镜状的羊膜敷料的方法和由此制备的用于治疗眼表疾病的隐形眼镜状的羊膜敷料，其不需使用缝合或粘附材料。本发明的隐形眼镜状的羊膜敷料能够解决与缝合羊膜有关的问题，例如，高精细的外科缝合技术、较长的手术时间、缝线脓肿、形成肉芽肿瘤、组织坏死和患者不适；以及与支撑物的使用有关的问题，例如，由于眨眼去除了支撑物、支撑物遭到破坏和引起不适。