专利名称：一种具有抗氧化活性的茶树菇发酵液多糖的制备方法茶树菇属担子菌纲，粪锈伞科，田菇属，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年来发展起来的一种食用菌新品种。茶树菇营养丰富，蛋白质含量高，含有人体必需的氨基酸，并且有丰富的B族维生素和钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。中医认为该菇性平、甘温、无毒，具有较高的药用价值，有清热、平肝、明目、健脾的功效。是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。目前，人们获得真菌多糖的途径主要是从真菌子实体提取而得，但随着需求量的增大，野生资源有限，人工栽培周期长且容易污染杂菌，受病虫害侵蚀，而菌丝体培养周期短， 染菌少，故应该探索在生物反应器内进行液体深层发酵以获取多糖的途径，为开辟工业化液体深层发酵生产真菌多糖提供可靠依据。通过深层发酵获得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可应用于保健品行业。
本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的茶树菇发酵液多糖的制备方法本发明的技术方案为将茶树菇子实体通过组织分离法接入固体斜面培养基上培养，待长好后移至摇瓶种子液体培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养基培养。发酵结束后，离心取上清液浓缩，乙醇沉淀，脱蛋白，脱色，凝胶层析柱纯化，透析后冷冻干燥得到茶树菇发酵液多糖。最后进行体外抗氧化实验。本发明发明的茶树菇发酵液多糖具有一定的抗氧化活性。可以作为原料应用于保健食品等领域。上述技术方案中，斜面培养基为PDA培养基，摇瓶种子培养基为PDAlL加磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6.0，发酵培养基为玉米粉2g/100mL、酵母粉 0. 3g/100mL、磷酸二氢钾 0. 2g/100mL、硫酸镁 0. 05g/100mL,培养条件为起始 pH6. 0，250mL 三角瓶装培养基IOOmL于25°C，150r/min，振荡培养7d。多糖提取方法为发酵结束后离心取上清液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/5，加入3倍体积95%乙醇在4°C醇析，沉淀物用蒸馏水复溶后用木瓜蛋白酶和kvage法联合去除游离蛋白，H2O2脱色、葡聚糖凝胶G-200 层析柱纯化，蒸馏水透析，冷冻干燥后得到茶树菇发酵液多糖。抗氧化试验将总还原能力， 清除羟基自由基、超氧阴离子、DPPH的能力作为指标。出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；(1)组织分离法斜面培养基PDA培养基，含1. 5% 2. 0%琼脂，pH自然；组织分离方法将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，PH自然，置于25°C温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；
(2)摇瓶种子培养
摇瓶种子培养基PDA1L加磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg， ρΗ6· 0 ；
培养方法从斜面菌种中取3 4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基IOOmL于25°C，150r/min，振荡培养7d ；
(3)摇瓶发酵培养
发酵培养基玉米粉2g/100mL、酵母粉0. 3g/100mL、磷酸二氢钾0. 2g/100mL、硫酸镁 0.05g/100mL ；
培养方法将培养好的种子以15%的接种量接入摇瓶发酵培养基中25°C，150r/ min,振荡培养7d ；
(4)发酵液浓缩，脱蛋白，脱色，凝胶柱层析，透析
培养后离心，取上清液旋转蒸发仪浓缩后用木瓜蛋白酶和kvage法联合去除游离蛋白，先在5%的糖溶液中加入(w/v)的木瓜蛋白酶于58士2°C，pH6.5条件下反应4h，然后按发酵液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡 20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。往脱蛋白后的溶液中加入氢氧化钠溶液，调至pH值8. 0左右，50°C以下滴加20%过氧化氢，至浅黄色，保温2h。将多糖溶液逐滴加入4°C无水乙醇中， 至乙醇浓度达到80 %，出现白色沉淀，4 °C条件下静置过夜，离心，用95 %乙醇、无水乙醇、 丙酮洗涤数次。待有机溶剂挥发完毕，将沉淀物用蒸馏水完全溶解，用kphadex G-200凝胶层析对多糖进行纯化，流动相为0. IM NaCl，流速0. 5mL/min,每管3mL。以苯酚-硫酸法在490nm处检测每管的糖浓度，测定该多糖的纯度。多糖复溶后装入透析袋中，扎紧袋口， 悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次，左后冷冻干燥，得多糖样品，采用苯酚-硫酸法测总糖含量，为98. 4%。
实例二
将制备得到的茶树菇发酵液多糖进行抗氧化活性实验，以蒸馏水为空白对照，以抗坏血酸为阳性对照，数据经SPSS13. 0软件分析。
1.实验方法
(1)还原力测定
在具塞试管中加入适量不同浓度的茶树菇多糖样品(0. 10-1.0mg/mL)、0.2mL PBS (2. 0M, pH 6. 6)和0. 5mL 铁氰化钾溶液。置50°C恒温水浴中反应20min，迅速冷却，再加入适量的10% (w/v)三氯乙酸溶液，3000*g离心lOmin，取上清液1. 5mL，加入 0. 2mLl%三氯化铁溶液和3. OmL去离子水，振荡均勻，静置5min，在λ 700处以蒸馏水为空白测定其吸光值。铁氰化钾[Kfe(CN)6]可被还原试剂还原成亚铁氰化钾[K/e(CN)6]，亚铁氰化钾再和铁离子作用生成普鲁士蓝，在OD7tltlnm处有最大吸收值，以检测其还原力。吸光值越大，说明其还原力越高。
(2)对羟自由基的清除
在试管中依次加入0. 2mL不同浓度的茶树菇多糖样品(0. 10-1. Omg/mL)，2. OmL的 EDTA-Fe (0. 15mM)，0. 8mL 水杨酸钠(2. OmM)，2. OmLH2O2 (6. OmM)，0. 8mL 去离子水。37°C反应 60min,于λ 510处测得不同茶树菇多糖浓度下的吸光值Ai,用水替代茶树菇多糖时的吸光值~，用水代替多糖和H2O2时测得空白对照吸光值Atl.按下式计算羟自由基(· OH)的清除率· OH 清除率(％ ) = [ (Ai-Aj) / (A0-Aj) ] X 100
(3)对超氧阴离子的清除
ImL的不同浓度(0. 10-1. Omg/mL)的茶树菇多糖样品以及2mL的Tris-HCl (16mM, pH 8. 0)溶解的76 μ M的NBT和394 μ M的NADH，加0. 4mL的56 μ M PMS，振荡均勻，室温反应5min，用Tris-HCl代替样品反应作为空白对照，测定A560nm值。
(4)对DPPH ·自由基的清除
样品管中加入0. 5mL不同浓度的多糖溶液(0. 10-1. Omg/mL)与3. OmL的0. 004% 溶于95%乙醇的DPPH溶液；对照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液。以上三组置于室温静置301^11后，用0.551^蒸馏水和3.01^ 95%的乙醇调零，于 517nm处测定吸光值。
结果显示
(1)还原力测定试验组和阴性对照组比较，P < 0.01，显示在还原力方面两者有高度显著性差异，表明其具有一定的还原力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，P > 0. 05，表明试验组不同浓度之间的还原力没有显著性差异；试验组与阳性对照组相比，P < 0. 05，表明多糖的还原力不及抗坏血酸。
(2)对羟基自由基的清除试验组和阴性对照组比较，P < 0.05，显示两者在对羟基自由基的清除方面有显著性差异，表明茶树菇多糖具有一定的清除羟基自由基能力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，当浓度小于0. 2mg/mL,P < 0. 05时，浓度大于0. 4mg/ mL时，P < 0. 05，表明多糖从0. 2mg/mL开始随着浓度的升高，其清除羟基自由基的能力增强；试验组与阳性对照组相比，P < 0. 05，表明多糖对羟基自由基的清除能力不及抗坏血酸。
(3)对超氧阴离子的清除能力试验组和阴性对照组比较，P < 0. 05，显示两者对超氧阴离子的清除率有显著性差异，前者清除超氧阴离子的能力高于后者；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，P < 0. 05，表明随着多糖浓度的增大，清除能力也相应增强，达到一定浓度时，趋于稳定；试验组与阳性对照组相比，P < 0. 05，表明多糖对超氧阴离子的清除能力不及抗坏血酸。
(4)对DPPH的清除能力试验组和阴性对照组比较，P < 0. 01，显示两者在对DPPH 的清除能力方面有高度显著性差异，表明多糖具有一定的清除DPPH能力；试验组不同浓度的多糖之间进比较时，P > 0. 05，表明试验组不同浓度之间对DPPH的清除能力没有显著性差异；试验组与阳性对照组相比，P < 0. 05，表明多糖对DPPH的清除能力不及抗坏血酸。


本发明属生物工程技术应用领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的茶树菇发酵液多糖的制备方法。该茶树菇发酵液多糖为白色或淡黄色粉末，是茶树菇通过深层发酵获得的发酵液经过浓缩、乙醇沉淀、脱蛋白、脱色、葡聚糖凝胶柱G-200层析、透析、冷冻干燥得到的。用苯酚-硫酸法测得多糖含量为98.4％，具有抗氧化活性，可应用于制备具有抗氧化，防衰老功能的保健品。