在胃肠系统中具有镇痛特性的嗜酸乳杆菌菌株的制作方法[0001]本申请是申请日为2005年9月21日、申请号为200580031540.5、发明名称为“在胃肠系统中具有镇痛特性的嗜酸乳杆菌菌株”的发明专利申请的分案申请。[0003]在微生物特别是细菌当中，有一些对免疫系统具有积极影响，特别是乳杆菌和双歧杆菌，它们被称为“益生”细菌或菌株。 [0004]通常，益生菌或菌株是指一种非病原微生物，其被活的摄取，对宿主的健康或生理具有有利作用。这些益生菌株通常能够活着通过消化道上部。它们是非致病非毒性的，一方面通过与消化道中的常居菌群的生态相互作用，另一方面通过它们以积极途径由“GALT”(消化道相关的淋巴组织)影响免疫系统的能力，而发挥它们对健康的有利作用。取决于益生菌的定义，当数量足够时，这些细菌能够活着通过肠，然而它们不能穿越肠屏障，因此它们主要影响于胃肠道腔和/或壁中。然后在给药期间，它们成为常居菌群的一部分。这种集群现象(或暂时集群现象)允许益生菌发挥有利作用，例如对存在于菌群中的潜在的病原性微生物的抑制，以及与肠免疫系统的相互影响。[0005]大多数所使用的益生菌，特别是乳制品中所使用的益生菌，主要是以下属的细菌和酵母:乳酸菌spp.,链球菌属spp.,肠球菌spp.,双歧杆菌属.，和酿酒酵母spp.。上述这些细菌的益生作用中，可提到的例如改善乳糖耐受性、预防或治疗胃肠和泌尿生殖器感染、减少肿瘤、降低血胆固醇水平。然而，必须强调，如果就单独的一株菌株来说，并不是如上所述的所有属的菌株都具有这些作用，仅仅只是它们中的一些具有这些作用，这些菌株必须慎重选择。[0006]为满足工业化的需要，必需发现有效的菌株或菌株混合物，并可以提供一种减少在胃肠水平中体验的疼痛的方案，这种胃肠疼痛通常表现为肠不适，特别是过敏性肠综合征(IBS)，或胃肠水平的由炎症所引起的疼痛，特别是在结肠炎或腹泻过程中。
[0007]因此，本发明要解决的问题是提供一种具有镇痛特性的益生菌。
[0008]为此目的，本发明提供嗜酸乳杆菌的至少一株菌株在制备制剂中的用途，该制剂以在胃肠系统的镇痛目的给药予人类或动物。
[0009]本发明还提供一种选择一种微生物来制备制剂的方法，该制剂以在胃肠系统的镇痛目的给药予人类或动物，该方法包含以下步骤:
[0010]i)使要试验的微生物与至少一个上皮细胞接触；
[0011]ii)检测至少一个上皮细胞中阿片样物质受体和/或大麻素受体的表达；[0012]本发明的优势在于提供确实的、将扩大有用菌株范围的优点。
[0013]本发明的另一个优势在于本发明的益生菌能用于胃肠系统的治疗或预防目的。
[0014]当本发明的益生菌以胃肠系统的治疗或预防目的给药予人类或动物，特别是减少在过敏性肠综合征中体验的疼痛或减少在由炎症反应所引起的疼痛，或调节肠炎时，本发明是特别有利的。
[0015]由于本发明的益生菌可以通过调整分泌和消化motricity而调节肠运输，因此当它以治疗或预防目的给药予人类或动物时，本发明也是有利的。
[0016]本发明的优势还在于，当该益生菌引入药学可接受制剂或引入食品时，它可保留所有其特性。
[0017]通过阅读以下说明和实施例，将更清楚地了解本发明的其他优势和特征，实施例仅仅是说明性而非限制性的。
[0018]本发明的主题是嗜酸乳杆菌的至少一株菌株在制备制剂中的用途，该制剂以在胃肠系统的镇 痛目的给药予人类或动物。
[0019]根据本发明，所使用的嗜酸乳杆菌是一种革兰氏阳性菌株。有利地，它是过氧化氢酶阴性的菌株，以同型发酵的代谢作用引起乳酸的产生。
[0020]根据本发明，所使用的嗜酸乳杆菌还可以产生细菌素，例如lactacin，活性对抗其他微生物。
[0021]优选地，它是一种能够在酸性pH环境下很好地耐胃蛋白酶、耐胰酶和耐胆汁盐的嗜酸乳杆菌。
[0022]优选地，使用被称为“疏水”的嗜酸乳杆菌，即，一种对极性的或非极性的疏水有机溶剂具有强烈的亲合性的嗜酸乳杆菌。疏水的有机溶剂例如为η-癸烷、氯仿、十六烷或二甲苯。
[0023]根据本发明，嗜酸乳杆菌菌株优选嗜酸乳杆菌ΡΤΑ-4797和嗜酸乳杆菌NCFM。根据布达佩斯条约，嗜酸乳杆菌的嗜酸乳杆菌ΡΤΑ-4797菌株已由法国Rhodia Chimie, 26, quaiAlphonse Le GaI1l92512B0UL0GNE_BILLANC0URT Cedex在美国典型菌种保藏中心(ATCC)注册，其中它的注册号为PTA-4797。该菌株在W02004052462中公开。
[0024]在根据本发明的用途的范围内，胃肠系统中的镇痛有利地通过阿片样物质受体和/或大麻素受体来调节。
[0025]所述的阿片样物质受体总共有三种:δ、K和μ。它们属于G蛋白偶联受体总科，其由七个跨膜螺旋组成。该受体的胞内部分与G蛋白接触，该G蛋白与受体相关，并可随着所使用的拮抗剂的种类而改变，蛋白质的主要顺序为Ga i3 > Ga ?2 > Ga il。
[0026]该阿片样物质受体，特别是μ受体，具有若干功能。主要的一个功能是镇痛作用，该作用通过利用β -内啡呔-或吗啡-型拮抗剂与该受体特定结合，通过血脑屏障而得到证实。该受体在消化道中的第二个功能是通过抑制分泌和消化motricity减少肠运输。最后，该阿片样物质受体还涉及调节肠炎。
[0027]该阿片样物质μ受体存在于中枢和外周神经系统中。已在大部分人体的重要器官中检测到它的存在:脾脏、肝脏、肾脏、小肠和结肠，特别是在粘膜下和肠系膜丛神经元中的肠神经系统中，以及，在体外的淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞和上皮细胞中。
[0028]大麻素受体，称为CBl和CB2，属于G蛋白偶联受体总科，其由七个跨膜螺旋组成。CBl主要通过中枢和外周神经系统表达，CB2主要通过免疫反应细胞表达。在人类，这些大麻素受体具有两种内原性配位体，其通常由肠上皮细胞生成。
[0029]由肠神经系统表达的大麻素受体CBl减缓胃和小肠的蠕动并抑制胃液分泌。推测大麻素受体具有其他的抗-diarrhoetic和抗癌功能。
[0030]在根据本发明的用途的范围内，胃肠系统中的镇痛优选通过阿片样物质μ受体和/或CBl受体和/或CB2受体调节。
[0031]本发明中所使用的制剂优选药学可接受的制剂或食品。
[0032]药学可接受的制剂尤其是指一种压制片、片剂、胶囊剂、软膏、栓剂或可饮用溶液形式的制剂。 [0033]优选地，本发明所用的制剂是食品，例如食品增补剂、酒或基于奶的粉末。它优选是动物或植物来源的乳制品。
[0034]乳制品是指含有动物和/或植物来源的奶的介质。可提及的动物来源的奶为牛奶、绵羊奶、山羊奶或水牛奶。可提及的植物来源的奶为任何可根据本发明使用的植物来源的发酵性物质，特别是源自大豆、大米或谷类。
[0035]根据本发明，所使用的更优选的制剂是发酵奶或母乳化牛奶。
[0036]用于制备本发明制剂的嗜酸乳杆菌菌株可以为细菌悬液、冷冻前后形式，浓缩形式，或者为干燥的、冻干的或冻结形式。无论使用哪种形式，菌株可以冷冻。
[0037]用于制备本发明制剂的嗜酸乳杆菌菌株可以包含不同的添加剂，所述添加剂在菌株的干燥或冻干过程中添加。
[0038]本发明所使用的嗜酸乳杆菌菌株可包含从IO6到IO12CFU的细菌/克载体，更优选从IO8到IO12CFU的细菌/克载体。CFU代表“菌落形成单位”。克载体优选指食品或药学可接受的载体，对于冻干形式，优选IO9到1012CFU/g。
[0039]用于制备本发明制剂的嗜酸乳杆菌菌株可以是与乳杆菌的混合物形式。根据本发明，所述乳杆菌是适宜的，包括通常用于农食品或制药工业的所有乳杆菌。
[0040]用于引导，最常使用于和存在于发酵剂中的所述乳杆菌是那些属于乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、白联珠菌属、小球菌属、双歧杆菌属、短颈细菌属、肉食杆菌属、肠球菌属、微球菌属、漫游球菌属、葡萄球菌属、杆菌属、克氏库克菌属、节核细菌属、Proprionibacterium和棒杆菌属。这些乳杆菌单独使用或混合使用。该列表是非穷举的。
[0041]本发明的主题还涉及一种选择一种微生物来制备制剂的方法，该制剂以在胃肠系统的镇痛目的给药予人类或动物，该方法包含以下步骤:
[0042]i)使要试验的微生物与至少一个上皮细胞接触；
[0043]ii)检测至少一个上皮细胞中阿片样物质受体和/或大麻素受体的表达；
[0044]步骤i)或ii)中使用的上皮细胞优选选自细胞株ATCC HTB-38，其通常称为HT-29株，或选自细胞株Caco-2。这些是结肠癌细胞系。上皮细胞还可以是从人类活组织切片中分离和纯化出来的细胞。
[0045]步骤i)优选在使用从IO8到IO12CFU的要试验的微生物和至少一个上皮细胞下进行。
[0046]步骤i)过程中的接触时间可以从O小时到24小时，优选3小时。
[0047]通常，根据步骤i)，在本领域技术人员所熟知的标准温度、气调和无菌环境之下进行与细胞的接触，特别是在体外上皮细胞培养环境下。
[0048]根据本发明选择的方法，步骤ii)优选在检测阿片样物质μ受体(MOR)和/或CBl受体和/或CB2受体的表达下进行。通常，仅可检测一种受体的表达:仅M0R、R CBl受体仅或CB2受体。或者，可检测两种受体的表达:M0R和CBl受体；M0R和CB2受体；CB1受体和CB2受体。或者，可检测三种受体的表达:M0R、CBl受体和CB2受体。
[0049]根据本发明选择的方法，步骤ii)优选检测阿片样物质受体和/或大麻素受体的信使RNA的表达以及任选其水平，例如由PCR，尤其由定量PCR或由免疫组织化学进行检测。也可使用本领域技术人员熟知的其他信使RNA的检测和它的测量技术。



[0050]图1表示阿片样物质μ受体的信使RNA作为时间函数的表达动力学，在由4种不同微生物刺激过程中 ，在ATCC ΗΤΒ-38上皮细胞中进行表达。
[0051]图2表示CBl受体的信使RNA作为时间函数的表达动力学，在由3种不同微生物刺激过程中，在ATCC ΗΤΒ-38上皮细胞中进行表达。
[0052]图3表示CB2受体的信使RNA作为时间函数的表达动力学，在由3种不同微生物刺激过程中，在ATCC ΗΤΒ-38上皮细胞中进行表达。
[0053]图4表示在不同环境下MOR的信使RNA的表达。
[0054]图5表示结肠TNF的alpha信使RNA在未经处理的老鼠和经L.acidophilus处理过的老鼠中的表达。
[0055]图6表示结肠KC的信使RNA在未经处理的老鼠和经L.acidophilus处理过的老鼠中的表达。
[0056]图7表示结肠IL-1 β的信使RNA在未经处理的老鼠和经L.acidophilus处理过的老鼠中的表达。
[0057]图8、10、12表示免疫染色的上皮细胞。图9、11、13表示免疫染色的上皮细胞的百分比。

[0058]以下实施例是为解释本发明，而非限制本发明的范围。
[0059]实施例1
[0060]1.上皮细胞的制备
[0061]在含有5% CO2的气氛、37°C下，分别用20和10%胎儿小牛血清，在DMEM介质中培养结肠癌细胞株HT-29(ATCC HTB-38)。ATCC HTB-38细胞株与要试验的不同菌株接触I ;3 ;4 ;8 ;18或24小时。回收ATCC HTB-38上皮细胞并浸于液氮中，以量化阿片样物质μ受体和/或大麻素受:体的彳目使RNA和蛋白质。
[0062]2.阿片样物质μ受体和/或大麻素受体的信息RNA的检测和量化:
[0063]实时PCR
[0064]培养基中的上皮细胞株的全部RNA通过使用柱萃取元件(Macherey-Nagel)分离出来。简言之，将细胞碾碎在含I % β-硫氢基-乙醇的溶解缓冲液中，然后通过第一柱，以取出所有残渣。用去氧核糖核酸酶(DNAse)处理后，由PCR实时(ABPrism7000，Perkin)在60°C的杂交温度下，使用阿片样物质μ受体或大麻素受体特定的引物将RNA转录成互补DNA:
[0065]-对于阿片样物质μ 受体(MOR)(正义:ATgCCAgTgCTCATCATTAC，反义:gATCCTTCgAAgATTCCTgTCCT)，对于参照基因:β-肌动蛋白(正义:TCACCCACACTgTgCCCATCTACgA,反义:CAgCggAACCgCTCATTgCCAATg)；
[0066]-对于CBl 大麻素受体，正义 CCT AGA TGG CCT TGC AGA TAC C;CB1 反义 TGT CATTTG AGC CCA CGT ACA G ;CB2 正义 GCT AAG TGC CCT GGA GAA CGT ;反义 TCA GCC CCA GCCAAG CT0
[0067]3.结果
[0068]结果列于图到3中。该结果由靶基因(β -肌动蛋白)/阿片样物质μ受体(MOR)和/或大麻素受体(CBl，CB2)之间的比例所表达。
[0069]阿片样物质μ受体和/或大麻素受体在ATCC ΗΤΒ-38上皮细胞株中表达(图1到3)。
[0070]一些微生物例如乳杆菌属菌株能够诱导阿片样物质μ受体和/或大麻素受体的信使RNA的表达。
[0071]该结果显示了阿 片样物质μ受体和/或大麻素受体的受培养基中上皮细胞的显著诱导。
[0072]使用嗜酸乳杆菌菌株时，这种诱导特别强烈。
[0073]图1和2显示，用嗜酸乳杆菌培养上皮细胞3小时之后，观察到阿片样物质μ受体(图1)和CBl (图2)的信使RNA的基础表达水平增加了约1000倍。
[0074]图3显示，用嗜酸乳杆菌培养上皮细胞3小时之后，观察到CB2 (图3)的信使RNA的基础表达水平增加了约100倍。
[0075]反之，使用共生大肠杆菌菌株(图1)，则没有检测到阿片样物质μ受体的诱导。由嗜酸乳杆菌菌株得到的阿片样物质受体和/或大麻素受体的诱导与由剂量为10ng/ml的TNF-α得到的诱导为同一数量级。
[0076]实施例2
[0077]1.原料和方法
[0078]菌株。
[0079]根据本发明，在37°C下，在 deMan Rogosa, Sharpe (MRS)肉汤(Becton Dickinson)中厌氧产生嗜酸乳杆菌NCFM菌株过夜。对于体外实验，使用达到指数生长期的细菌。在动物接种之前，用革兰氏染色法评估培养基的纯度。
[0080]动物和实验性的感染。
[0081]根据政府指南,在来自Lille的Institut Pasteur,在公认设施中进行动物试验。12小时的白天周期下，每个笼子中安放五个Balb/c老鼠，老鼠可自由使用标准老鼠食物和自来水。在十四天中，一天一次，通过胃强饲法使动物接受再悬浮在0.5 % CMC (羧甲基纤维素，Sigma)中的IO9CFU的嗜酸乳杆菌菌株。通过颈脱臼法处死动物。切除动物身上的所有结肠并切成两部分。一部分固定在4%酸性多聚甲醛中过夜并埋入石蜡中。另一部分结肠用于my-阿片样物质受体(MOR)、大麻素受体(CBl和CB2)和炎性细胞因子TNF a、KC和IL-1 β的mRNA的量化。[0082]TNBS结肠炎的诱导和研究设计。因为MOR的表达由炎症调节(Philippe D等人，JCI2003 ；Pol O et al，MoI Pharmaco12001 ；Pol O et al,Curr Top Med Chem2004)，我们使用TNBS-诱导的结肠炎作为正调控。根据政府指南，在来自Lille的lnstitut Pasteur,在公认设施中进行动物试验。每个笼子中安放五个Balb/c老鼠，老鼠可自由使用标准老鼠食物和自来水。对于结肠炎诱导，使老鼠麻醉90-120分钟，并接受TNBS的直肠内给药(40 μ 1,150mg/kg)，所述TNBS溶解在0.9% NaCl: 100%乙醇为1:1的混合物内。对照组老鼠使用相同的技术接受0.9% NaCl: 100%乙醇为1:1的混合物或盐溶液。TNBS给药后4天处死动物。
[0083]定量实时PCR
[0084]根据厂家说明书，用Rneasy 兀件(Macherey Nagel, Hoerdt, France)将全部 RNA从整个结肠组织中分离出来。用分光光度测定法进行RNA的量化。在37C下用20-50单元的无 RNase 的 DNase I (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN,USA)处理 30分钟后，用寡-dT 探针(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA)接合单股cDNA。在 GeneAmpAbiprism7000 (Applera, Courtaboeuf, France)里，用带特定的老鼠寡聚核苷酸(见表 I)的 SYBR green Master Mix (Applera, Courtaboeuf, France)量化 mRNAs。每个试验包括定刻度标准对照和无模板对照。每个样本重复做三次。用Abiprism7000SDSsoftware (Applera, Courtaboeuf, France)分析SYBR绿色染料强度。所有结果标准化到未受影响的看家基因肌动蛋白。
[0085]表1
[0086]