专利名称：附加了水溶性长链分子的修饰的促红细胞生成素的制作方法为了改善贫血，以基因重组方法生产促进造血的激素即促红细胞生成素(有时记为ΕΡ0)，提高了其作为治疗贫血症的药品的实际效果。已知在人来源的EPO上附加水溶性长链分子聚乙二醇(有时记为PEG)，可阻止EPO在肝脏中的代谢，延长其在血液中的寿命 (专利文献1)。通过该延长在血液中停留时间的效果，实现了延长药效的持续时间、减少给药频率的优点，因而，不限于ΕΡ0，其他被PEG修饰了的蛋白质制剂作为新一代药品已获得瞩目，其中一部分已被实际应用。在将蛋白质进行PEG修饰的情况下，所附加的PEG的分子量越高，又或者附加数目越多，则蛋白质具有越难以被代谢的倾向。因而，向体内给药附加了多个大分子量的PEG分子的蛋白质时，预计所述蛋白质在血液中的寿命将变长(非专利文献1)。另一方面，在通过结合受体而表达生理活性的EPO等蛋白质的情况下，所附加的水溶性长链分子的分子量越大、附加数目越多，则在体内的生理活性越低。在用PEG修饰具有上述人来源的序列的EPO(有时记为人ΕΡ0)的情况下，据报道， 大鼠尾静脉单次给药52位赖氨酸上附加了 1分子PEG的PEG修饰EPO(有时记为单PEG 体)，其造血活性(以网织红细胞的增加为指标)的持续效果好(专利文献1)。另一方面，目前使用的人EPO制剂是经静脉、皮下、肌肉内等途径给药的。此外，也可致力于经口、经鼻吸收制剂的研究(专利文献2)。血管内给予人EPO制剂缺乏通用性，希望有给药方法更简便、注射后的疼痛等患者负担少，并且药效持续的EPO制剂。据报道，人类中由慢性肾功能不全或化疗剂或外科手术等引起的贫血症状，也可见于宠物动物的猫或狗中，占这些动物的大多数死因。例如以猫(日本国内)为例，1996年以来的10年间，慢性肾功能不全由0. 64%大幅增加至3. 95%，在疾病排位中由第28位增加至第4位(非专利文献2)。在动物的贫血治疗中，也使用EPO制剂进行治疗。但是，由于EPO样生理活性蛋白质具有物种固有的氨基酸序列，因此在人以外的动物中给予人来源的EPO制剂，可能会导致抗EPO抗体的表达。由此可见，近年来，对具有各种固有氨基酸序列的猫或狗治疗用EPO制剂的实用化展开了研究。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开W002/3^57
专利文献2 日本特开昭62-89627
非专利文献
__专禾1J文献 1 :Polyethylene glycol-conjugated pharmaceutical proteins ； PSTT，第 1 卷，第 8 期，1998，352-356
非专利文献2 多摩兽医临床研究会调查报告(2006年度)发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供含有EPO为有效成分、具有高生理活性、且在生物体内的稳定性高的药物组合物，所述药物组合物的特征是通过给药于人和/或动物后，造血效果维持7天以上。
解决课题的方法
技术领域：
本发明人就使用PEG对EPO进行化学修饰展开了详细探讨，结果发现根据PEG的附加数目、分子量或构造，造血效果维持7天以上，从而完成了本发明。
换言之，本发明涉及这样的药物组合物，其特征在于，含有附加了 2分子以上水溶性长链分子的促红细胞生成素，其占全部促红细胞生成素中的50%以上。
此外，本发明涉及这样的药物组合物，其特征在于，含有附加了水溶性长链分子的促红细胞生成素，且所述水溶性长链分子的分子量在30kDa以上。
此外，本发明涉及这样的药物组合物，其特征在于，含有附加了水溶性长链分子的促红细胞生成素，且所述水溶性长链分子具有支链。
水溶性长链分子优选是一种以上选自聚乙二醇、聚氨基酸和聚丙二醇的化合物。
在人和/或动物中的造血效果优选维持7天以上，上述动物优选是猫科和/或犬科的动物。
本发明的药物组合物是溶液或凝胶，上述溶液或凝胶的pH优选是4以上且8以下。
优选溶液组成与哺乳动物体液的渗透压和pH实质上相同，在给药时无疼痛。
优选促红细胞生成素是由人、猫或狗来源的氨基酸序列组成的。
促红细胞生成素优选是以下的(a) (C)
(a)具有序列号1记载的氨基酸序列的多肽，
(b)由与序列号1记载的氨基酸序列具有70%以上的序列同一性的氨基酸序列组成的多肽，其在使用BaF/EPOR细胞进行细胞增殖测定时具有促红细胞生成素活性，或者
(c)相对于序列号1记载的氨基酸序列，取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸的多肽，其在使用BaF/EPOR细胞进行细胞增殖测定时具有促红细胞生成素活性。
优选聚乙二醇的附加部位的至少一个位点是78位赖氨酸残基。
优选即使反复给药，也不产生针对促红细胞生成素的抗体。
此外，本发明还涉及含有上述药物组合物的治疗贫血的药物和造血药物。
发明效果
通过将本发明的药物组合物给药于人或动物，造血效果可以持续7天以上。给药本发明药物组合物的制剂时，具有减少注射后的痛感等的患者负担，且药效持续的效果。
附图简单说明


图1 将PEG修饰的EPO给药于大鼠的造血效果的比较，所述PEG修饰的EPO附加了不同分子数的分子量为20000的直链PEG。
图2 将PEG修饰的EPO给药于大鼠的造血效果的比较，所述PEG修饰的EPO附加了不同分子数的分子量为5000的直链PEG(对照附加了 1分子的分子量为20000的直链PEG的单PEG化猫ΕΡ0)。
图3 将PEG修饰的猫EPO给药于大鼠的造血效果的比较，所述PEG修饰的猫EPO 附加了 1或2分子的分子量为40000的直链PEG(对照附加了 1分子的分子量为20000的直链PEG的单PEG化猫ΕΡ0)。
图4 将PEG修饰的猫EPO给药于大鼠的造血效果的比较，所述PEG修饰的猫EPO 附加了 1或2分子的分子量为20000的支链PEG(对照附加了 1分子的分子量为20000的直链PEG的单PEG化猫ΕΡ0)。
发明的
1.本发明涉及3种药物组合物。
第一种本发明涉及如下药物组合物，所述药物组合物含有附加了 2分子以上水溶性长链分子的促红细胞生成素(有时记为ΕΡ0)，其占全部促红细胞生成素中的50%以上。
在第一种本发明中，附加到EPO上的水溶性长链分子的数目是2分子以上，优选是 2分子。也可以含有附加了 1分子水溶性长链分子的ΕΡ0，但是从造血效果持续性的观点来看，附加了 2分子以上水溶性长链分子的EPO在全部EPO中的含量优选是作为主要成分的， 更优选为50%以上，进一步优选为70%以上。
在此，附加了 2分子以上水溶性长链分子的EPO在全部EPO中的含量，是在通过 SDS-PAGE分级后，由荧光染色所获得的条带的荧光强度计算得出的。
附加了 2分子以上水溶性长链分子的EPO是全部EPO中的主要成分，是指附加了 2 分子以上水溶性长链分子的EPO在SDS-PAGE中显示为最浓的条带。在此，在SDS-PAGE中显示为最浓的条带是指进行了 SDS-PAGE电泳后的样品中所包含的蛋白质在例如利用SYPRO Ruby等的荧光染色法检测时，来自附加了 2分子以上水溶性长链分子的EPO的信号强度比其他的信号强度都高。
附加了 2分子以上水溶性长链分子的EPO是全部EPO中的主要成分，还可以通过 HPLC进行确定。例如，通过测定吸光度来检测经过YMC PackDio 1-200 (株式会社YMC制造) 等柱子的样品，确定来自附加了 2分子以上水溶性长链分子的EPO的信号强度比其他信号强度都高。
从造血效果持续性的观点来看，水溶性长链分子的分子量优选是在IOkDa以上， 更优选是在20kDa以上。在低于5kDa的条件下，存在着造血效果不持续的倾向。
此外，第二种本发明涉及如下药物组合物，所述药物组合物含有附加了水溶性长链分子的促红细胞生成素，所述水溶性长链分子的分子量在30kDa以上。
在第二种本发明中，附加到EPO上的水溶性长链分子的数量没有特殊限制，可以是1分子，也可以是2分子以上。
从造血效果持续性的观点来看，水溶性长链分子的分子量优选为30kDa以上，更优选为40kDa以上。在低于20kDa的条件下，存在着造血效果不持续的倾向。
此外，第三种本发明涉及如下药物组合物，所述药物组合物含有附加了水溶性长链分子的ΕΡ0，所述水溶性长链分子具有支链。水溶性长链分子具有支链是指，分支的支数为2以上，分支点数为1以上。
在水溶性长链分子是支链的情况下，附加到EPO上的水溶性长链分子的分子数没有特殊限制。即使所附加的水溶性长链分子的分子数是1分子，也实现了在给予药物组合物时造血效果持续7天以上的效果。此外，附加具有支链的PEG的方法记载于日本特表平 9-504299号公报中。
下面对上述药物组合物中的水溶性长链分子、给药方法和效果、容器以及促红细胞生成素进行说明。
2.水溶性长链分子
以阻碍代谢、延长在血液中的动态为目的，向EPO上附加水溶性长链分子。对水溶性长链分子没有特殊的限制，可以使用例如PEG(聚乙二醇)、聚氨基酸、聚丙二醇等。可以将这些水溶性长链分子制备为反应前体，通过合成反应附加到蛋白质上。也可以用基因重组方法，生产结合了上述分子的蛋白质。其中，由于PEG没有抗原性且无毒，在降低所修饰的蛋白质的抗原性，抑制抗EPO抗体表达的副作用等方面是有效的。
一般而言，使PEG共价键合在蛋白质上的方法有与蛋白质或糖链的可氧化官能团的化学反应，所述官能团是多元醇、乳醇(Iactol)、胺、羧酸或羧酸衍生物。此外，有使用磺酸酯活化的聚合物，例如磺酸酯活化PEG的方法。在附加到EPO上的情况下，可以使用这些方法来附加。
可以使用长链分子的一个末端的甲氧基化物作为PEG化反应前体。此外，开发了在没有甲氧基化的末端进行琥珀酰亚胺脂肪酸酯化的PEG，其中从反应性的观点来看，脂肪酸优选丙酸或丁酸。已知使甲氧基PEG的琥珀酰亚胺丙酸酯(称为SPA-PEG)与人EPO反应，将选择性的附加到赖氨酸残基上。由于EPO中存在多个赖氨酸残基，随着反应的进行， PEG的附加数目增加，成为附加数目不同的异构体混合物。
虽然根据大鼠尾静脉单次给药人EPO的结果报告在52位赖氨酸附加单个 PEG(20kDa)的单PEG体具良好的持续造血效果，但是根据EPO来源的动物物种、给药途径， 最合适的异构体或其混合比例不同。PEG的附加数目为1的PEG修饰EP0、PEG的添加数目为2以上的PEG修饰ΕΡ0，可以分别单独给药，也可以作为混合物给药。
此外，关于PEG在EPO蛋白质上附加的部位，应根据EPO来源的物种、反应形式不同来考虑，即使在附加多个PEG的情况下，优选至少一个位点是与人EPO的52位赖氨酸对应的赖氨酸残基。例如，在由序列号1组成的猫EPO中，优选78位赖氨酸。
3.给药方法和效果
结果，本发明的含有EPO的药物组合物，在人和/或动物中的造血效果持续7天以上。
造血效果可以以给药本发明的药物组合物时的造血活性为指标，造血活性以红细胞前体的网织红细胞占红细胞的比例来定量。网织红细胞数可以通过色素染色的涂抹实验或者用自动血细胞计数器来测定。
药物组合物的给药对象没有特殊的限制，可以给药于人和人以外的动物。对人以外的动物没有特殊的限制，优选是猫科和/或犬科的动物。如下文所述，在使用猫来源的 EPO的情况下，在猫科和/或犬科的动物中，EPO成为抗原的可能性低，可以避免发生副作用。
对药物组合物的给药方法没有特殊的限制，可列举静脉内给药、皮下给药、口服给药、肌肉内给药、经皮给药、经鼻给药等。
本发明的经PEG修饰的EPO可以使用选自药理学上可接受的赋形剂、崩解剂、粘合剂的试剂。
赋形剂可以例举淀粉、琼脂、白糖、乳糖、葡萄糖、糊精、山梨糖醇、阿拉伯树胶、玉米淀粉、甘露糖醇、结晶纤维素、卵磷脂、磷酸钙、硫酸钙，也可以使用除此以外的制药上可接受的赋形剂。
崩解剂为淀粉、琼脂、柠檬酸钙、碳酸钙、碳酸氢钠、糊精、结晶纤维素、羧甲基纤维素、黄蓍胶，也可以使用除此以外的制药上可接受的崩解剂。
粘合剂可以例举淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、阿拉伯树胶、黄蓍胶、明胶、 糖类、乙醇、聚乙烯醇，也可以使用除此以外的制药上可接受的粘合剂。
本发明中的经PEG修饰的ΕΡ0，可以使用选自稳定剂、pH调节剂和渗透压调节剂、 表面活性剂的试剂。
稳定剂可以例举氨基酸。在此，作为稳定剂使用的氨基酸可以是结晶的，也可以是无定形的，也可以使用含有高比例的上述氨基酸且含有植物、动物成分等杂质的氨基酸。作为结晶，可以使用L型、D型或DL混合型。
pH调节剂，在缓冲体系中包括选自例如醋酸/醋酸盐、苹果酸/苹果酸盐、柠檬酸 /柠檬酸盐、酒石酸/酒石酸盐、乳酸/乳酸盐、磷酸/磷酸盐、甘氨酸/甘氨酸盐、TRIS、谷氨酸/谷氨酸盐，和碳酸钠中的体系。含有EPO的凝胶或溶液的pH下限优选是4，更优选是 4. 5，进一步优选是5。pH上限优选是8，更优选是7. 5，进一步优选是7。
渗透压调节剂包括盐类、糖类、醇类和氨基酸类，但不限于此。特别是可以恰当的使用氯化钠、多元醇类、一元醇类、单糖类、二糖类、寡糖和氨基酸类，或它们的衍生物等。
上述多元醇可使用例如甘油等三元醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇等五元醇、甘露糖醇、山梨糖醇、卫矛醇等六元醇等。其中，六元醇是优选的，特别优选的是甘露糖醇。
上述一元醇可列举例如甲醇、乙醇、异丙醇等，其中优选乙醇。
上述单糖可使用例如阿拉伯糖、木糖、核糖、2-脱氧核糖等五碳糖类，葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖，鼠李糖、岩藻糖等六碳糖类，其中优选六碳糖。
上述寡糖可使用例如麦芽三糖、棉籽糖等三糖，水苏四糖等四糖，其中优选三糖。
作为上述的单糖类、二糖类和寡糖类的衍生物，可使用例如葡糖胺、半乳糖胺、葡糖醛酸、半乳糖醛酸等。
本发明的PEG修饰的EPO还可进一步含有表面活性剂。表面活性剂可列举阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂，但不限于此。阴离子型表面活性剂可列举例如脂肪酸类阴离子型表面活性剂、直链烷基苯类阴离子型表面活性剂、高级醇类阴离子型表面活性剂、α烯烃类阴离子型表面活性剂和正链烷烃类阴离子型表面活性剂，但不限于此。非离子型表面活性剂可列举例如脂肪酸类非离子型表面活性剂、高级醇类非离子型表面活性剂、烷基酚类非离子型表面活性剂，但不限于此。 此外，以非离子型表面活性剂为例，可列举例如聚山梨醇酯和/或聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯，但不限于此。两性表面活性剂可列举例如氨基酸类、甜菜碱类和氧化胺类，但不限于此。阳离子型表面活性剂可列举例如季铵盐类，但不限于此。
可以任意组合上述赋形剂、崩解剂、粘合剂、稳定剂、pH调节剂、渗透压调节剂和表面活性剂。此外，可以添加除赋形剂、崩解剂、粘合剂、稳定剂、PH调节剂、渗透压调节剂和表面活性剂以外的制药上允许的添加剂。可列举例如润滑剂、包覆剂、着色剂、防凝聚剂、吸收促进剂、助溶剂、健康食品原料、营养添加食品原料、维生素、香料、甜味剂、防腐剂、保存剂、 抗氧化剂等。
制剂可以是将溶液、凝胶或粉末加工后的溶液制剂、冷冻干燥制剂、预装填的注射剂、皮下包埋的缓释制剂、胶束制剂、凝胶化制剂、脂质体制剂等。
使用溶液状的含有EPO的药物组合物的情况下，重要的是溶液组成与哺乳动物体液(渗透压280m0sm/Kg H2O, pH :7. 4)的渗透压和pH实质上相同，在皮下给药时无疼痛。 使用溶液状的含有EPO的药物组合物的情况下，本发明可以优选使用渗透压在400m0sm/Kg H2O以下的溶液状药物组合物。此外，可以恰当的使用200m0sm/Kg H2O以上的溶液状药物组合物。
4.容器
即使微量给药EPO也能在生物体内产生效果，因此，制剂对容器壁的吸附造成的损失将对生物体给药时的实际活性产生很大影响。因此，优选本试剂的容器是蛋白质吸附很少的树脂制品。因而，期待选择EPO在容器上的吸附量占容器中EPO总量的以下的材料。优选选择0. 7%以下，更优选选择0. 5%以下的原材料。
对已知蛋白质吸附少的树脂材料没有特殊的限制，包括聚乙烯(PE)、聚丙烯 (PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸乙酯等医用容器材料。已知蛋白质吸附少的树脂材料优选是如下树脂，例如降冰片烯或四环十二碳烯或它们的衍生物等环烯烃类开环聚合物及其氢化物，通过降冰片烯或四环十二碳烯或其衍生物等环烯烃与乙烯或丙烯聚合，在分子链中插入环戊基残基或取代环戊基残基而形成的共聚物。进一步地， 从吸附少的观点来看，优选以四环十二碳烯与乙烯等链烯烃为原料的共聚物的环烯烃共聚物(COC)，此外，同样优选降冰片烯开环聚合并加氢的聚合物，即环烯烃聚合物(COP)(参见日本特开平5-300939号或日本特开平5-317411号)。
5. EPO的氨基酸序列
EPO的氨基酸序列可以是来自任何生物的序列。除人以外，在小鼠、大鼠、狗、猫等中也进行EPO的cDNA克隆(VENLA =Blood, 82,1507(1993))，解出了分别编码的氨基酸序列。本发明中不仅可以使用人ΕΡ0，也可以使用具有人以外的物种所固有的氨基酸序列的 EPO。
在本发明中，EPO的氨基酸序列优选是人或食肉目动物来源的氨基酸序列。食肉目动物优选是猫科或犬科动物，更优选是猫科动物。
已知猫EPO与人EPO的序列同一性是83. 4%，此外，在CHO细胞中表达的猫EPO对猫具有造血活性(Am. J. Vet. Res. 64，1465-71 (2003))
已知贫血的原因有大出血、维生素不足、自身免疫疾病、恶性肿瘤、慢性炎症、慢性肾功能不全、溶血和造血异常等。由于上述原因的贫血不仅存在人中，而且在宠物动物狗、 猫，或家畜牛、马、绵羊、山羊、猪或用于生态研究的在动物园等中饲养、公开展示的狮子、老虎、袋鼠、象、长颈鹿、斑马、考拉、熊猫等中也发病，可以通过本发明的EPO治疗上述贫血。 猫EPO可以用于治疗猫、狮子和老虎等猫科动物(Felidaae)的贫血。此外，猫EPO与狗EPO 的序列同一性高，对分类学上的猫目(食肉目)的狗和犬科动物(Canidae)也有效。
上述动物与人不同，由于没有用输血用血液的血库，因此对事故、手术等时间的失血难以实施输血措施。而且，对于上述动物，本发明的造血效果长期持续的EPO制剂可以代替输血或者也可以在打点滴时使用。给药时，如果动物感觉到疼痛就会妨碍给药，且对于大型动物而言，可能对兽医有危险，可以通过配制与给药对象动物的体液组成接近的渗透压、 PH，使疼痛最小化。
猫科来源的EPO的氨基酸序列优选是序列号1所示的氨基酸序列。
此外，本发明的EPO也包含由与序列号1记载的氨基酸序列具有70%以上序列同一性的氨基酸序列组成的多肽。
EPO多肽与序列号1所示的氨基酸序列的序列同一性优选在70%以上，更优选 80%以上，进一步优选85%以上，进一步优选90%以上，最优选95%以上。
此外，EPO在不损害造血活性的条件下，也可以是取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸的多肽。导入的突变数量优选不超过50个，更优选不超过40个，进一步优选不超过30个，更进一步优选不超过20个，最优选不超过10个。
EPO的制备方法除了以通常可获得的动物细胞(例如CHO细胞)、原核生物、酵母作为宿主制造重组品外，还可以利用从天然物质中获得的ΕΡ0，用重组动物制造的EPO等， 对此没有限制。制造EPO的重组动物也可以利用基因重组的鸟类。此外，EPO可以是纯化制品也可以是未纯化状态，但基于质量管理的观点，优选纯化制品。
为了纯化ΕΡ0，可以单独或组合使用常规的蛋白质回收手段进行纯化，所述常规的蛋白质回收手段有盐析法、吸附柱层析法、离子交换柱层析法、凝胶过滤柱层析法、抗体柱方法，但不限于此。吸附柱层析法有蓝色琼脂糖层析、肝素层析等，离子交换柱层析法是阳离子交换层析或阴离子交换层析等。实施例
通过以下实施例详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。在以商品名记载的情况下，只要没有特别说明，遵守所附说明书的指示。
猫来源的促红细胞生成素的合成按照日本特开2007-89578中记载的方法进行， 其步骤重新记载如下。
(制备例1)向鸡胚显微注射逆转录病毒载体并人工孵化
将猫来源的促红细胞生成素的表达用转录病毒载体显微注射至鸡胚，制备表达猫来源的促红细胞生成素的转基因鸡。显微注射和人工孵化都在无菌条件下进行。用消毒液 (株式会社昭和furanki生产)和乙醇对鸡受精卵(城山种鸡场生产)的外侧进行除菌。 将孵卵器P_008(B)型(株式会社昭和furanki生产)设定为38°C、湿度50-60%的环境， 接通电源之时为开始孵化的时刻(0小时)，之后每15分钟将卵翻转90°，进行孵化。
在开始孵化后约55个小时，从孵卵器中取出卵，用带有钻石刀(刀尖直径20mm、 轴直径2. 35mm)的微型车床(mini-router) (PR0XX0N生产)在其尖端切出直径3. 5mm的圆形。在鸡双黄卵(城山种鸡场生产)的尖端切出直径4. 5cm的圆形，将受精卵的内容物移到该除去了内容物的卵壳中，用注射器的内筒将胚胎移至上方。在实体显微镜SYSTEM SZX12 (OLYMPUS株式会社生产)下，将病毒液注入femto chip II (Eppendorf株式会社生产)中，用femto Jet (Eppendorf株式会社生产)显微注射约2μ1的含有日本特开 2007-89578中记载的猫来源的促红细胞生成素表达用转录病毒载体的溶液。
使蛋清为浆糊状，切下约8 X Scm2的保鲜膜(旭化成株式会社生产)，堵住该孔，放回孵卵器中继续孵化。孵卵器的转卵改为每30分钟转卵30°。在开始孵化起的第20天， 用20G的注射针头在保鲜膜上钻开20个左右的孔，以60cc/分钟向孵卵器中提供氧气，进行孵卵。当幼雏开始啄壳时，切开卵壳使之孵出。将诞生的幼雏喂养长大。饲料使用幼雏 SX Safety和Neo&ifetyl7 (丰桥饲料株式会社生产)。通过后述的BaF/EPOR细胞增殖测定，确定猫来源的促红细胞生成素在转基因鸡的血液中和卵中表达。
(制备例2、从蛋清中纯化猫来源的促红细胞生成素
回收在蛋清中确认了猫来源的促红细胞生成素活性的鸡个体的卵，使用后述柱子从蛋清中回收、纯化猫来源的促红细胞生成素。
上样至柱子上的所有样品，在使用前均用孔径0. 45 μ m的Millex-HX(日本 Millipore株式会社生产)进行注射器过滤。在难以过滤的情况下，用孔径2μπι的 Puradisc25 (WATT MANN生产)预过滤后，再通过Millex进行过滤。
纯化过程中的猫来源的促红细胞生成素的含量测定，用Biacore 3000 (GE HealthCare Japan株式会社· BIAC0RE生产)进行。用氨基偶联试剂盒(GE HealthCare Japan株式会社’BIACORE生产)将抗人促红细胞生成素单克隆抗体(R&D Systems公司生产)NHS固定在传感芯片CM5研究级(GE HealthCare Japan株式会社· BIAC0RE生产)上作为测定用芯片，以Epozine作为标准物质，使用装置的定量程序测定浓度。
为了将蛋清上样至柱子上，进行了降低粘度的预处理。将冷藏保存的卵恢复到室温，打开卵，使用卵壳等将蛋黄与蛋清分离后，只回收蛋清并测定重量。用搅拌器搅拌蛋清而打散浓厚的蛋清，加入5倍量的超纯水，进一步搅拌。此时，蛋清液的PH为9. 0-9. 3左右。其中适当加入IN HC1，调节至pH 5.0，搅拌15分钟以上后，在4°C下，9，500G离心30 分钟。向上清液中加入IM NaOH，调节至pH 7. 0，加入IM pH 7. 0的Tris缓冲液，至终浓度为50mM。在该步骤中，猫来源的促红细胞生成素的回收率最高为95%。
然后，进行蓝色琼脂糖层析。将500ml (2-3个蛋清)预处理后的蛋清液上样于以 50mM Tris、pH 7.0 平衡过的 50ml Blue Sepharose 6Fast Flow 柱(GE HealthCare Japan 株式会社.Amersham生产)上。用50mM Tris、pH 7. 0充分清洗柱子后，用200ml的IMNaCl, 50mM Tris、pH 7. 0进行洗脱。在4°C的低温室下，通过普通方法用20mM的MES、pH 6. 2对洗脱的级分透析过夜，进行缓冲液交换。在该步骤中，猫来源的促红细胞生成素的回收率最高为98%。
然后，进行肝素层析。分两次将蓝色琼脂糖洗脱级分(透析后)上样于用20mM 的 MES、pH 6. 2 平衡过的 HiPr印 16/10Heparin FF 柱(GE HealthCareJapan 株式会社· Amersham生产)上，分别用20mM的MES、pH 6. 2充分清洗柱子后，进行梯度洗脱，直至 NaCl浓度上升至80mM。每次用IM NaCl和0. IMNaOH再生柱子。回收通过Biacore确认了存在猫来源的促红细胞生成素的级分。在该步骤中，猫来源的促红细胞生成素的回收率最高为80%。
然后，通过脱盐柱进行缓冲液交换。通过级分分子量5，000的 VIVASPIN20 (Sartorius Mechatronics Japan株式会社生产)，将肝素琼脂糖层析洗脱级分浓缩至总量30-40ml左右，以每次IOml上样于用25mM Tris, pH 7. 0平衡过的Hift^p 26/10Desalting(GE HealthCare Japan 株式会社· Amersham 生产)上，用同一缓冲液洗脱，回收含有蛋白质的级分。用IM NaOH调节至pH 9.0，进一步用IM NaCl调节至电导率为3. 0-3. anS/cm。在该步骤中，猫来源的促红细胞生成素的回收率最高为95%。
然后，进行阴离子交换柱层析。分两次将缓冲液交换后的样品上样于用25mM Tris、pH 9. 0、电导率为 3. 0-3. 2mS/cm 的缓冲液平衡过的 5mL HiTrapDEAE FF 柱(GE HealthCare Japan株式会社· Amersham生产)上，回收流经而不吸附的级分。每次用IM NaCl再生柱子。通过级分分子量5，000的VIVA SPIN20将其浓缩至总量2_3ml左右。在该步骤中，猫来源的促红细胞生成素的回收率最高为92%。
进行凝胶过滤层析。将浓缩后的样品上样于用50mM硼酸缓冲液、pH 9. 0或其他合适的缓冲液平衡过的Superdex 200 10/300GL柱(GE HealthCareJapan株式会社· Amersham生产)上，用同一缓冲液洗脱。回收用Biacore确认了存在猫来源的促红细胞生成素的级分，通过级分分子量5，000的VIVASPIN6将其浓缩至总量l_2ml左右。在该步骤中，猫来源的促红细胞生成素的回收率最高为93%。
对纯化各步骤的回收级分进行SDS-PAGE。样品使用12. 5%的e -PAGEL,在变性条件下电泳，用 Bio-Safe Coomassie Main(Bio-RadLaboratories 株式会社生产)检测。
通过下述方法，对从蛋清纯化的猫来源的促红细胞生成素进行BaF/EPOR细胞增殖测定。其结果是比活性为160，000-290，000IU/mg。
按照如下所述向猫来源的促红细胞生成素上附加PEG。
实施例1 附加了 PEG的猫来源的促红细胞生成素(PEG化猫EPO)的合成反应
使用纯化的猫EPO溶液(20mM磷酸缓冲液，pH = 7.0)，附加下列PEG试剂。
分子量5000的直链PEG (日油株式会社生产ME_050HS)
分子量20000的直链PEG (日油株式会社生产ME_200HS)
分子量40000的直链PEG (日油株式会社生产ME_400HS)
分子量20000的支链PEG，分支数1 (日油株式会社生产GL2_200GS2)
按猫EPO和PEG试剂的摩尔比1 5的比例混合后，在4°C下边混合边反应。通过附加PEG，首先生成单PEG体，然后生成二 PEG体，之后再生成寡PEG体，因此通过HPLC (株式会社岛津制作所生产)监测各个PEG体的生成状态，在获得足够量时终止反应。此外，柱子使用YMC PackDiol-200 (正相柱、株式会社YMC生产)。
当生成足够量的各PEG体时，添加1/10量的IOOmM甘氨酸溶液作为反应终止剂， 在4°C混合1小时，使反应终止，透析反应液(50mM醋酸缓冲液，pH = 4. 5)。
实施例2 通过纯化PEG反应液来分离纯化PEG化猫EPO
为了分离回收通过PEG反应生成的单PEG体、二 PEG体、寡PEG体和未反应的PEG、 未反应的ΕΡ0，用阳离子型交换柱进行了分离纯化。
通过阳离子型交换柱(MacroCapSP =GE HealthCare · Japan株式会社生产)分离纯化反应液(结合50mM醋酸缓冲液(pH = 4. 5)，洗脱1M NaCl梯度)。按寡PEG体、二 PEG体、单PEG体的顺序，分别收集按照盐浓度分离洗脱出的峰，并对其进行透析QOmM磷酸缓冲液(pH = 7. 5)，150mMNaCl)。添加0. 05% (V/V)的聚山梨醇酯80 (和光纯药工业株式会社生产)作为分散剂，作为给药的样品。
(评价1)猫EPO和附加了PEG的猫EPO的活性测定
对实施例2合成的各种PEG化猫EPO进行了体外活性测定。
猫EPO的活性是通过EPO依赖性细胞株BaF/EPOR细胞((财)化学及血清疗法研究所)的细胞增殖测定(日本特开平10-9439 来进行测定的。细胞增殖测定以 Epozine (中外制药株式会社生产)作为标准促红细胞生成素，绘制其增殖校正曲线，以此为基础测定未知样品的EPO活性。使用含有5%胎牛血清(FBQ和50单位/ml的青霉素和链霉素的RPMI1640液体培养基(日水制药株式会社生产)作为BaF/EPOR细胞的培养基。 在培养常规的BaF/EPOR细胞时，添加Epozine，使得终浓度为lU/ml。细胞增殖测定使用对数增殖期的细胞。
为了用BaF/EPOR细胞进行细胞增殖测定，首先去除培养基中的Epozine。将培养的BaF/EPOR细胞在IOOOrpm离心分离5分钟。去除上清液，加入IOml不含Epozine的培养基悬浮沉淀。重复进行3次同样的操作，去除培养基中的Epozine。计数细胞，用不含Epozine的培养基稀释至55555细胞/ml的浓度。分别在96孔微滴度板的各孔中接种90 μ L0其中分别加入10 μ L用培养基稀释至25、16、10、6· 4,4. 0,2. 5,1. 6,1. 0U/ml的 Epozine，进行同样的悬浮(使EPO的终浓度分别为2. 5,1. 6,1. 0,0. 64,0. 4,0. 25,0. 16、 0. lU/mL)。
用培养基分别将测定用样品以2-4倍左右梯度稀释，使其落入校正曲线的测定范围内，分别将IOyL样品加至接种的细胞中，进行同样的悬浮。将标准样品和未知样品同时测定相同的3点。培养2天，向各孔分别添加IOyLCell Counting Kit_8(株式会社同仁化学研究所生产)溶液。进行1-4小时的显色反应后，加入10μ L的0. lmol/L的盐酸，终止反应，使用微滴度板读数器，测定在450nm下的吸光度。将标准样品的测定结果进行对数拟合，计算拟合公式。依据求得的拟合公式换算出样品的活性。
表1中显示了测定结果。
表1
体外比活性(I. U./mg)


本发明的课题是提供含有以促红细胞生成素为有效成分的药物组合物，其通过向人和/或动物给药，维持7天以上的造血效果。本发明提供了药物组合物，所述药物组合物的所有促红细胞生成素中含有50％以上的促红细胞生成素附加了2分子以上水溶性长链分子的促红细胞生成素。此外，本发明提供了药物组合物，其含有附加了水溶性长链分子的促红细胞生成素，且所述水溶性长链分子的分子量在30kDa以上。进一步地，本发明提供了药物组合物，其含有附加了水溶性长链分子的促红细胞生成素，且所述水溶性长链分子具有支链。