专利名称：包括1081c＞a突变的cyp2c9基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用的制作方法CYP2C9是细胞色素P450酶大家族CYP2C亚家族中最重要的一员，约占人肝微粒体CYP酶总量的20%。有大约10 16%临床常用药物经由CYP2C9氧化代谢，其中主要包括甲苯磺丁脲、S-华法林、苯妥英、格列吡嗪、格列苯脲、托拉噻咪、氯沙坦、厄贝沙坦和许多非甾体类抗炎药物(如布洛芬、氯诺昔康、双氯芬酸和萘普生)等药物(参见参考文献1-5)。CYP2C9基因具有高度多态性。目前为止，国际上已命名的等位基因共有35种(http://www. cypalleles. k1. se)，除去野生型(CYP2C9*1)外，共有34种突变类型可引起CYP2C9蛋白氨基酸组成发生改变，另外还有多种新发现的突变尚未被命名。研究较多且临床意义较大的突变类型主要包括以下10种CYP2C9*2、*3、*5、*6、*8、*11、*12、*13、*14、*16，其中人种分布最广、研究最多、中国人群研究资料相对最丰富的突变型是CYP2C9*2 (430C > T)、CYP2C9*3 (1075A > C)(参见参考文献 6-17,20)。根据目前的临床 研究显示，CYP2C9基因的这种多态性是造成CYP2C9酶活性在个体之间极大不同的主要原因，因此在携带不同CYP2C9基因型的个体间可引起药物疗效的极大差异，甚至产生严重的药物毒副作用或治疗不充分。因此，研究CYP2C9基因多态性对药物疗效的影响将对临床合理用药提供重要的科学依据(参见参考文献18、19、21、22)。
本发明的目的是提供CYP2C9基因的新的单碱基突变位点，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及鉴定该突变位点在用药指导中的应用。本发明的第一个方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ IDN0.1的第1001位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1001位的核苷酸是A ;或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO. 2的第1081位的突变位点，且是SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1081位的核苷酸是A ;或者为上述核酸片段的互补序列。本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID NO.1的第1001位或对应于SEQID NO. 2的第1081位的突变位点的等位基因片段或其互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第1081位的突变位点的核苷酸是A ;所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其互补序列。本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含SEQ IDN0. 12和/或SEQ IDNO. 13和/或SEQ ID NO. 21所示的序列片段。本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸在检测CYP2C9基因突变中的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物。本发明的第五个方面是提供一种用药指导，包括检测待测样品中CYP2C9基因的对应于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第1081位的单碱基突变；根据检测到的突变，调整由CYP2C9代谢的药物的给药量。 本发明的第六个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO. 2的序列的核酸中对应于第1081位的核苷酸。本发明的第七个方面是提供CYP2C9蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQID NO. 3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO. 3的第361位的异亮氨酸，并且为SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。本发明提供了包含新的单碱基突变的CYP2C9基因和编码序列。该基因在对应于SEQ ID NO. 2的第1081位核苷酸由C突变为A(1081C>A)，从而引起其编码的氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸，即对应于SEQ ID NO. 3的第361位的异亮氨酸。该突变的CYP2C9蛋白(命名为L361I)对药物几乎无代谢活性。该单碱基突变对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。图1是本发明的SEQ ID NO.1的第1001位核苷酸测序图谱。
说明本发明，但本发明内容不限于此。如无其它说明，本发明的“核酸片段”由核苷酸或其类似物组成，可以是DNA、RNA或其类似物的片段；可以是单链或双链；可以是天然的(如基因组的)或合成的。本发明中，“突变”指在检测的基因，即CYP2C9基因中存在与野生型CYP2C9基因序列不同的核苷酸位点。“突变位点”指碱基发生突变的位置。在本发明中，所述突变位点是对应于SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或SEQ ID NO. 2所示序列中的第1081位。在本发明中，“等位基因特异性”指特异地与等位基因杂交，如在严谨条件下进行杂交，使得鉴定对应于SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或SEQ IDN0. 2所示序列的第1081位核苷酸为A。本发明内容涉及CYP2C9基因的非同义突变。由于该突变位点位于基因的编码序列中，因此，本领域技术人员可知，所述突变位点既可以在基因组DNA中表现，也可以在编码序列(即CDS，对应于mRNA序列)中表现。本领域技术人员根据待检测样品，可以在基因组DNA或mRNA水平上对该突变位点进行检测。本申请中，SEQ ID NO.1是以本申请的突变位点为中心、前后各Ikb的基因组DNA序列，即SEQ ID NO.1的第1001位是本发明涉及的突变位点。SEQ ID NO. 2是具有所述突变位点的CYP2C9基因的编码序列，其中第1081位是本发明涉及的突变位点。本领域技术人员可知，在本文中，对应于SEQ ID NO. 2的第1081位位点和对应于SEQ ID NO.1的第1001位位点同义互用。本发明中，核苷酸和氨基酸的缩写采用本领域公知的缩写方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鸟嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。氨基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示谷氨酰胺，E表示谷氨酸，G表示甘氨酸，H表示组氨酸，I表示异亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示赖氨酸，M表示蛋氨酸，F表不苯丙氨酸,P表不脯氨酸，S表不丝氨酸,T表不苏氨酸，W表不色氨酸，Y表不酪氨酸，V表示缬氨酸。本发明的内容是基于CYP2C9基因的新的单碱基突变位点。所述突变位点是位于CYP2C9基因的编码区内，对应于SEQ ID NO. 2的第1081位，该位点由野生型的C突变为A(1081C > A);此外，由该突变的CYP2C9基因编码的蛋白的第361位由亮氨酸突变为异亮氨酸(L361I)。在第一个方面，本发明提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ IDN0.1的第1001位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1001位的核苷酸是A ;或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO. 2的第1081位的突变位点，且是SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10个·连续核苷酸，其中第1081位的核苷酸是A ;或者为上述核酸片段的互补序列。在一种实施方式中，所述核酸片段的长度可以是如10-100、100-200、200-500、500-1000个核苷酸。优选地，所述核酸片段的长度是10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-100或100-300个核苷酸。所述突变位点可以位于所述核酸片段的任何位置。在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.1所示的序列。在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO. 2所示的序列。在其它实施方式中，所示核酸片段可以是SEQ ID NO. 24-27所示的序列。本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID NO.1的第1001位或对应于SEQID NO. 2的第1081位的突变位点的等位基因片段或其互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第1081位的突变位点的核苷酸是A ;所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其互补序列。在一种实施方式中，所述的寡核苷酸用作探针。所述探针能够在严谨条件下与包含突变位点的靶序列特异性杂交。本领域技术人员已知，所述探针不需要与靶序列完全互补，只要能与靶序列特异杂交即可。在优选的实施方案中，所述杂交条件可以满足使探针仅与靶序列特异性杂交。所述探针的长度可以是5-100个核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。所述突变位点可以出现在探针的任何位置。在优选的实施方式中，是突变位点出现在探针序列的中心或大约中心处。在另一种实施方式中，所述寡核苷酸用作指导DNA合成的引物，如本领域公知的测序引物或合成引物等。所述引物不需要与模板完全互补，但应当与模板互补杂交以指导DNA合成。所述引物的长度可以是15-40个核苷酸长度，优选地为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。所述突变位点可以出现在所述引物的任何位置；优选地，所述突变位点出现在所述引物的3’末端。在一些优选的实施方式中，所示寡核苷酸是如SEQ ID NO. 28-33所示的序列。基于此，本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含SEQ ID NO. 12和/或SEQ ID NO. 13和/或SEQ ID NO. 21所示的序列片段。本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸用于检测CYP2C9基因突变的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物。本发明的第五个方面是提供用药指导，包括检测待测样品中CYP2C9基因的对应于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第1081位的单碱基突变。当检测到的CYP2C9基因在对应于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ IDN0. 2的第1081位的位点为A时，相对应地调整经CYP2C9代谢的药物的给药量。在具体的实施例中，当CYP2C9基因在SEQ ID NO. 2的第1081位的位点为A时，该基因编码的CYP2C9蛋白酶活性下降，故需要减少经CYP2C9代谢的药物的给药量。本发明中所述的经CYP2C9代谢的药物包括抗癌药物，如环磷酰胺、异环磷酰胺或紫杉醇；抗凝血药，如华法林、醋硝香豆素、抗惊厥药或美芬妥英；降糖药，如甲苯磺丁脲、那格列奈、吡格列酮或罗格列酮；抗癫痫药，如苯妥英或唑尼沙胺；抗疟药/抗寄生虫药，如阿莫地喹、盐酸氯胍或奎宁；抗精神病药，如阿米替林、西酞普兰、丙咪嗪、哌罗匹隆、舍曲林、硫利达嗪或文拉法辛；降压药，如氯沙坦、厄贝沙坦或缬沙坦；非类固醇性抗炎药，如双氯芬酸、氨基比林、安替比林、塞来昔布、氟比洛芬、布洛芬、Π引哚美辛、氯诺昔康、甲芬那酸、萘普生、吡罗昔康或替诺昔康；镇痛药，如、洛哌丁胺、美沙酮或吗啡；质子泵抑制剂，如兰索拉唑或奥美拉唑；镇静药，如、氯巴占、甲苯比妥或佐匹克隆。本发明的第六个方面 是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO. 2的序列的核酸中对应于第1081位的核苷酸。在一种实施方式中，所述方法可以是测序法，包括分离并测定来自基因组DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的对应于第1001位的核苷酸或包含对应于SEQ ID NO. 2的序列的核酸中的对应于第1081位的核苷酸是否为A。测序法可以是本领域已知的任何可用的测序方法。测序引物可以根据本领域技术人员的常识进行设计，如在待检测位点的上下游适当位置处设计引物，以扩展包含该待测位点的片段，从而判断该位点的核苷酸。也可以采用本发明的寡核苷酸作为引物序列。在另一种实施方式中，所述方法是利用探针杂交的方法，特异性地鉴定检测样品中包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的对应于第1001位的核苷酸或包含对应于SEQID NO. 2的序列的核酸中对应于第1081位的核苷酸是否为A ;所述方法中采用的探针是本发明的寡核苷酸。例如，从待测样品中分离出核酸，在允许探针与核酸中可能存在的特异性靶序列杂交的条件下使探针与核酸接触；可被检测的杂交可以通过使用由可检测的试剂标记过的探针来实现；例如，用放射性同位素、荧光染料或能催化形成可检测产物的酶来标记探针。标记探针、用标记探针检测样品中是否存在靶序列的方法都是本领域技术人员所熟知的。
在一种具体的实施方式中，提供以Taqman探针SNP检测法检测对应于SEQ IDNO.1的第1001位的核苷酸的方法，包括I)设计引物用于特异性扩增包含对应于SEQ ID NO.1的第1001位的PCR产物，同时设计两条Taqman-MGB探针，分别针对对应于SEQ ID NO.1的第1001位的C和A (如SEQID NO. 32所不序列)等位基因。引物设计原则为(I)序列选取应在基因的保守区段；(2)避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；(3)引物长度在18到24个核苷酸；(4) Tm 值在 55_65°C，GC 含量在 40% -60% ；(5)引物之间的Tm值相差避免超过2 V ；

(6)引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的喊基；(7) PCR 扩增片段长度在 50bp_150bp ；(8)引物末端最后5个核苷酸不能有超过2个的G和C。Taqman MGB探针设计原则为(I)探针的5’端避免出现G ；(2) Tm 值应为 65-67 °C ;(3)尽量缩短Taqman MGB探针,但探针长度不少于13bp ；(4)尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，避免出现4个或4个以上的G重复出现；(5)将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。荧光基团可以采用FAM、VIC等来标记两个等位基因。2)利用上述引物和探针，对待测样本进行实时定量PCR。PCR条件95°C预变性10分钟后进入30个扩增循环92°C变性12秒，60°C退火及延伸I分钟(此阶段检测荧光信号)。3)数据分析。分析实验结果，根据样本两种荧光的强弱判定待测样本CYP2C9基因是否存在1081C > A 突变。本发明中，所述样品可以是任何包含核酸的样品，如血液；优选所述样品来自于人。所述核酸可以是DNA或编码RNA，优选为基因组DNA。本发明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA为目标物。本领域技术人员可知，当以DNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQ ID NO.1的序列设计；当以RNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQID NO. 2的序列的核酸中对应于第1081位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQ IDNO. 2的序列设计。本发明的第七个方面是提供CYP2C9蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQID NO. 3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO. 3的第361位的异亮氨酸，且为SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸，如10_20、20_50或50-100
个氨基酸。下面将通过具体的实施例进一步说明本发明，但以下具体的实施例仅出于示例性的目的。实施例实施例1 :人CYP2C9基因新的突变位点的鉴定本实施例中，采集2127份血液样本，提取血液中的基因组DNA，设计测序引物对CYP2C9基因的9个外显子进行序列扩增、测序，筛选CYP2C9基因的突变位点I)提取 DNA 从每位被测者采取5ml静脉EDTA抗凝血液样本；然后按照普通盐析法和/或采用专门的DNA提取试剂盒(购自美国Omega公司的DNA提取试剂盒)提取待测血样的基因组DNA。2) PCR 扩增 设计扩增引物，对获得的基因组DNA样品中的CYP2C9基因的9个外显子序列进行扩增。所述扩增引物对序列见表I。采用50μ1 PCR反应体系，包括1XPCR缓冲液、1. 5mM MgCl2、100 150ng的基因组DNA、上下游引物均为O. 2 μ M、dNTP为O. 4mM、TaKaRa公司的LATaq DNA聚合酶1. 5U。PCR扩增循环参数如下94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，退火30秒，72°C延伸2分30秒，30个循环后再延伸5分钟。退火温度与引物长度相关，具体温度见表I。使用美国ABI公司的GeneAmp PCR System 9700扩增仪扩增。表1:测序引物对及退火温度


本发明属于生物学领域，涉及单碱基突变。更具体地，本发明涉及CYP2C9基因对应于SEQ ID NO.2的第1081位的突变位点，所述位点由野生型的C突变为A，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及其应用。本发明还提供了检测所述突变位点的等位基因特异性寡核苷酸、试剂盒和检测方法。